[发明专利]一种重组病毒及利用该病毒生产L-天冬酰胺酶Ⅱ的方法

权利要求书

1.一种重组病毒，其特征在于它是通过以下方法制备的：

①以家蚕杆状病毒DNA为模板，以SEQ ID No.1和SEQ ID No.2分别为上下游引物，通过PCR扩增反应，制得具有BamHⅠ酶切位点和EcorⅠ酶切位点的扩增产物polh；以大肠杆菌JM109基因组DNA为模板，以SEQ ID No.3和SEQ ID No.4分别为上下游引物，通过PCR扩增反应，制得具有BamHⅠ酶切位点和Hind Ⅲ的扩增产物asp；

②将polh通过BamHⅠ和EcorⅠ俩酶切位点双酶切克隆至pFastbac1质粒，制得重组质粒pFastbac1-polh；将asp 通过BamHⅠ和Hind Ⅲ俩酶切位点双酶切克隆至pFastBacHTB质粒,制得重组质粒pFastBacHTB-asp；

③以重组质粒pFastBacHTB-asp为模板，以SEQ ID No.4和SEQ ID No.5分别为上下游引物，通过PCR扩增反应，制得具有EcoRⅠ酶切位点和Hind Ⅲ酶切位点的扩增产物tev-asp；

④将tev-asp通过EcoRⅠ和Hind Ⅲ俩酶切位点克隆至pFastbac1-polh质粒，制得重组质粒pFastbac1-polh-asp；

⑤将重组质粒pFastbac1-polh-asp在大肠杆菌Bm DH10Bac中转化，并在含有抗生素的环境中培养，然后通过蓝白斑筛选获得阳性菌斑，再从该阳性菌斑中抽提质粒DNA；再将该质粒DNA转染家蚕细胞BmN细胞，转染后分离培养基上清液，获得含有家蚕杆状病毒的多角体蛋白基因和大肠杆菌的L-天冬酰胺酶Ⅱ基因的重组病毒；

SEQ ID No.1：AGGGATCCatgccgaattattcatac；

SEQ ID No.2：CCGAATTCatacgccggaccagtgaa；

SEQ ID No.3：GAGGGATCCGAAAACCTGTATTTTCAG；

SEQ ID No.4：GGAAGCTTTTAGTACTGATTGAAGATCTGCT；

SEQ ID No.5：GAGGAATTCGAAAACCTGTATTTTCAG。

2.利用权利要求1所述病毒生产L-天冬酰胺酶Ⅱ的方法，其特征在于：用上述病毒感染家蚕，在该家蚕的BmN细胞中，分离得到以共价键连接多角体蛋白的L-天冬酰胺酶Ⅱ，然后通过纯化所述多角体蛋白来纯化所述以共价键连接多角体蛋白的L-天冬酰胺酶Ⅱ，再通过TEV酶酶切去除以共价键连接多角体蛋白的L-天冬酰胺酶Ⅱ的多角体蛋白，制得纯净的L-天冬酰胺酶Ⅱ。