[发明专利]一种重组病毒及利用该病毒生产L-天冬酰胺酶Ⅱ的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种重组质粒，属于生物科学技术领域。

背景技术

L-天冬酰胺酶Ⅱ，能专一性地催化L-天冬酞胺水解生成L-天冬氨酸和氨。它是一种重要的蛋白类抗肿瘤药物，在临床上广泛用于淋巴瘤和儿童急性淋巴细胞白血病(ALL )的治疗, 还可用于黑素肉瘤、霍金森病、胰腺癌等疾病的治疗。目前, L-天冬酰胺酶Ⅱ的生产大多采用以大肠杆菌为宿主的基因工程菌,在生产上存在着生产水平低和分离纯化步骤繁多两方面问题。

发明内容

本发明的目的提供一种重组病毒，该病毒具有多角体基因和L-天冬酰胺酶Ⅱ基因，因此可通过将该重组病毒转移到家蚕中生产出以共价键连接多角体蛋白的L-天冬酰胺酶Ⅱ，再通过多角体进行分离纯化L-天冬酰胺酶Ⅱ，该重组病毒在家蚕体内具有表达水平高的特点，通过多角体进行分离纯化得到的L-天冬酰胺酶Ⅱ具有纯度高的特点。

本发明的上述技术目的是通过以下技术方案得以实现的：

一种重组病毒，它是通过以下方法制备的：

①以家蚕杆状病毒DNA为模板，以SEQ ID No.1和SEQ ID No.2分别为上下游引物，通过PCR扩增反应，制得具有BamHⅠ酶切位点和EcorⅠ酶切位点的扩增产物polh；以大肠杆菌JM109基因组DNA为模板，以SEQ ID No.3和SEQ ID No.4分别为上下游引物，通过PCR扩增反应，制得具有BamHⅠ酶切位点和Hind Ⅲ的扩增产物asp；

②将polh通过BamHⅠ和EcorⅠ俩酶切位点双酶切克隆至pFastbac1质粒，制得重组质粒pFastbac1-polh；将asp 通过BamHⅠ和Hind Ⅲ俩酶切位点双酶切克隆至pFastBacHTB质粒,制得重组质粒pFastBacHTB-asp；

③以重组质粒pFastBacHTB-asp为模板，以SEQ ID No.4和SEQ ID No.5分别为上下游引物，通过PCR扩增反应，制得具有EcoRⅠ酶切位点和Hind Ⅲ酶切位点的扩增产物tev-asp；

④将tev-asp通过EcoRⅠ和Hind Ⅲ俩酶切位点克隆至pFastbac1-polh质粒，制得重组质粒pFastbac1-polh-asp；

⑤将重组质粒pFastbac1-polh-asp在大肠杆菌Bm DH10Bac中转化，并在含有抗生素的环境中培养，然后通过蓝白斑筛选获得阳性菌斑，再从该阳性菌斑中抽提质粒DNA；再将该质粒DNA转染家蚕细胞BmN细胞，转染后分离培养基上清液，获得含有家蚕杆状病毒的多角体蛋白基因和大肠杆菌的L-天冬酰胺酶Ⅱ基因的重组病毒；

SEQ ID No.1：AGGGATCCatgccgaattattcatac；

SEQ ID No.2：CCGAATTCatacgccggaccagtgaa；

SEQ ID No.3：GAGGGATCCGAAAACCTGTATTTTCAG；

SEQ ID No.4：GGAAGCTTTTAGTACTGATTGAAGATCTGCT；

SEQ ID No.5：GAGGAATTCGAAAACCTGTATTTTCAG。

本发明的另一个目的在于提供一种利用上述病毒生产和提纯L-天冬酰胺酶Ⅱ的方法。

一种利用上述病毒生产和提纯L-天冬酰胺酶Ⅱ的方法：用上述病毒感染家蚕，在该家蚕的BmN细胞中，分离得到以共价键连接多角体蛋白的L-天冬酰胺酶Ⅱ，然后通过纯化所述多角体蛋白来纯化所述以共价键连接多角体蛋白的L-天冬酰胺酶Ⅱ，再通过TEV酶酶切去除以共价键连接多角体蛋白的L-天冬酰胺酶Ⅱ的多角体蛋白，制得纯净的L-天冬酰胺酶Ⅱ。

本发明所实现的技术效果如下:

本发明将多角体蛋白基因和大肠杆菌L-天冬酰胺酶Ⅱ基因中间以TEV酶酶切位点对应的核苷酸连接构建成融合基因，通过转移载体在Bm DH10Bac中与BmBacmid同源重组形成含有多角体蛋白基因和大肠杆菌L-天冬酰胺酶Ⅱ基因的重组BmBacmid，通过转染家蚕细胞BmN所获得的重组病毒恢复了多角体基因，因而在观察病毒感染的细胞时，会看到多角体。这种表达系统不仅可以获得更多的融合大肠杆菌L-天冬酰胺酶Ⅱ，而且蛋白可以通过多角体来纯化，简化了纯化的流程。通过TEV酶酶切去除多角体蛋白，获得纯的大肠杆菌L-天冬酰胺酶Ⅱ。