[发明专利]蒜头果仁凝集素及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种铁青树科蒜头果仁凝集素及其制备方法，属植物凝集素提取或制备工艺技术领域。

背景技术

凝集素是一类由动植物及微生物细胞分泌的非酶和非免疫的蛋白质或多价糖结合蛋白，因一般能凝集某些细胞(如红细胞)而称之，其家族成员不断增加，功能复杂多样，如促有丝分裂、病毒的毒力决定、凝集恶性细胞、精子、骨髓细胞等。由于凝集素具有高度的糖结合专一性，已成为研究生物学和临床医学非常有用的工具，用于分离纯化和确定糖复合体、细胞分裂、鉴定微生物、肿瘤诊断、治疗及预防骨髓移植等，某些凝集素具有阻断HIV攻击CD4细胞能力，如乳杆菌凝集素（徐进等:中国生物制品学杂志,2008,9:792-795）、黄精凝集素（CN200610005577）等。不同来源的凝集素有不同的凝集谱和应用价值（刘雪兰等:中华绒螯蟹血清凝集素的生物学特性,中国水产科学2006,3:335-340），有不同的提取制备工艺和方法，如亲和层析法（CN028243196）等。

蒜头果（Malana oleifera）又名马兰后（广西壮语音）、米民、猴子果、唛厚、山桶果等，属铁青树科蒜头果属，是我国特有单种属稀有植物，国家二级保护树种。主要分布在广西西部和云南东南部的狭窄地带，是典型的油料作物，种仁含油率高达64.5%，油脂既可食用，又是合成麝香酮(muscone)、昆虫信息素等的工业原料（赵劲平,欧乞鍼:蒜头果仁油的应用研究,中国油脂,2010,7:12-16）。迄今为止，前人已在蒜头果果油脂肪酸组成和含油量、濒危原因和保护、果油脂肪酸和木材的开发利用、生态适应特征、组织培养等方面取得一定的研究成果，但总体水平还停留在起步阶段。发明专利200510010633将蒜头果在不高于4℃的低温条件下捣碎，过滤，上清液用30-100%硫酸铵分级沉淀，透析，再通过蛋白质分离专用的色谱仪器纯化，获得SDS-PAGE电泳纯、分子量32kD和23kD的两个亚基构成的55kd抗癌蛋白。然而，直至目前，尚无蒜头果仁凝集素研究及应用的报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种从蒜头果属植物中提取的凝集素及其制备方法。

本发明提供一种蒜头果仁凝集素，包括下列质量组分：

蛋白质 60～80%，       多糖 15～30%。

所述蒜头果仁凝集素用于兔、猪、鸡、鸭、鼠的红细胞凝集，抗HIV活性。

本发明的另一目的在于提供一种蒜头果仁凝集素的制备方法，经过下列各工艺步骤：

A．将干燥的蒜头果仁粉碎，按固液比为1︰3～8溶解于水中，水温为0～10℃，在0～10℃温度下搅拌10～48h，然后将此混合物进行过滤，得到黄色透明滤液；

B．向滤液中加入硫酸铵粉末，并搅拌溶解直至硫酸铵饱和度达25～40%时停止加入，在0～10℃下静置1～2小时后，于0～10℃、转速为1000～8000rpm下进行离心分离，取其上清液继续加入硫酸铵粉末至饱和度达60～75%，静置1～2小时后，于0～10℃、转速为1000～8000rpm下进行离心分离，去除上清液，取其沉淀物，即为凝集素粗品；

C．将步骤B所得凝集素粗品用蒸馏水溶解后进行超滤或透析除盐，得浓缩液；

D．将步骤C所得浓缩液经过离子交换层析，用0.02mol/L的Tris-HCl缓冲液挂柱，使样品吸附，用0.02mol/L的Tris-HCl缓冲液与浓度从0.1%NaCl线性逐渐升高到6%NaCl的盐溶液进行线性浓度梯度洗脱，用兔红细胞检测凝集活性，收集有凝集活性的组分，再经超滤或透析除盐、浓缩、冷冻干燥，即得蒜头果仁凝集素，其包括下列质量组分：蛋白质 60～80%，多糖 15～30%。

所述步骤A中干燥的蒜头果仁粉碎粒度为40～200目。

所述步骤C和D中超滤或透析除盐的膜透过分子量≤10kd。

步骤D所得蒜头果仁凝集素SDS-PAGE变性电泳呈单一条带(即未见杂蛋白条带)、分子量60kd，蛋白含量80～90%(凯氏定氮法)，糖含量5～10%（硫酸苯酚法）,可使兔、猪、鸡、鸭、鼠的红细胞凝集的效价达1:10⁶以上(即≤1 μg/ml)，抗HIV活性IC₅₀≤50μg/ml。