[发明专利]一种抗菌肽、其制备方法和用途

说明书

技术领域

本发明属于生物医学和生物技术领域，具体而言，本发明涉及一种抗菌肽、所述抗菌肽的制备方法及其用途。

背景技术

由于抗生素药物的广泛使用已经造成许多致病菌产生抗性，目前生物医药界将越来越多的精力投入到新概念药物——抗菌肽领域。

抗菌肽是在整个生物界内广泛存在的一类双亲性小分子碱性多肽，其可见于各种生物体内，例如细菌、真菌、植物、昆虫、鱼类、鸟类、甲壳动物、两栖动物和哺乳动物等。目前已有抗菌肽超过750种之多，其中绝大部分为阳离子抗菌肽，也有少量阴离子抗菌肽。

抗菌肽表现出广谱抗微生物活性，并对细菌毒素有中和作用，其作用机制独特，不易产生耐药性，而且某些抗菌肽只对原核生物和突变细胞起作用，对真核生物无害，因而在许多致病菌产生了明显耐药性的情况下，抗菌肽的发现和深入研究为开发全新的抗菌药物提供了可能。然而，虽然抗菌肽可以作为一类具有广谱高效抑菌效果、致病菌很难产生耐性的新概念药物，但是，天然抗菌肽来源极为有限，在抗菌肽作为新药研究和开发中，抗菌肽的获得也是亟待解决的问题。

发明内容

本发明的目的在于提供一种新型抗菌肽。

本发明的另一个目的是提供所述抗菌肽的制备方法。

此外，本发明的有一个目的是提供所述抗菌肽在制备抗菌药物中的用途。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

一方面，本发明提供一种抗菌肽，所述抗菌肽包含SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列。

优选地，所述抗菌肽为SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的肽。

其中，所述抗菌肽分离自长角血蜱，分子量为5.3kDa，等电点为8.68。

另一方面，本发明提供制备上述抗菌肽的方法，所述方法包括：1)收集长角血蜱的唾液；2)将步骤1)中收集到的唾液进行超速离心过滤；以及3)将步骤2)中得到的滤液组分进行凝胶过滤层析。

此外，上述制备方法进一步包括：4)将步骤3)中通过凝胶过滤层析得到的洗脱液通过HPLC反相高效液相色谱进行纯化。

优选地，上述方法的步骤1)包括：

兔血饲喂长角血蜱使之体重达200-300μg，然后将该血蜱清洁干净，使用唾液分泌诱导剂诱导血蜱分泌唾液，当观察到血蜱开始分泌唾液后，将血蜱放在34.5-35.5℃、优选35℃的盒子中2-3小时，之后收集该长角血蜱分泌的唾液并于-70℃储存备用；

优选地，所述唾液分泌诱导剂为毛果芸香碱，诱导剂量为每只长角血蜱0.8-1.1μg、优选1μg的毛果芸香碱，初次给至血蜱后每隔20分钟添加0.5μg毛果芸香碱，直到观察到血蜱分泌少量唾液为止。

上述方法的步骤2)优选包括：

取200-300μl步骤1)中收集到的长角血蜱唾液，使用截留分子量为10kDa的YM-10滤膜和截留分子量为3kDa的YM-3滤膜于4℃超速离心，得到组分II，即分子量在3-10kDa之间的滤液。

上述方法的步骤3)优选包括：

将步骤2)中得到的组分II加到Superdex Peptide 10/300凝胶过滤层析柱上，柱子规格：10mm×300mm，并且过滤柱用30％(体积比v/v)的乙腈甲醇溶液(乙腈为溶质，甲醇为溶剂)和0.1％(体积比v/v)甲酸(甲酸溶于水)预平衡，然后以5μl/min的流速收集第3个洗脱峰的洗脱液。

上述方法的步骤4)优选包括：

采用0.3mm×150mm C8磁性柱、ABI 140D泵和785A紫外检测仪，以2或5μl/min的速度灌柱；溶液A为含10％甲醇和0.1％甲酸的水溶液(体积比v/v)，溶液B组分为30％(体积比v/v)乙腈甲醇溶液和0.1％(体积比v/v)甲酸溶液；

色谱柱用前用溶液A预平衡，柱子平衡后将步骤3)中得到的第3个峰的洗脱液加到柱子上，然后再以梯度10％-95％加入溶液B，流速控制在5μl/min，持续20min，然后流速调整到2μl/min，然后用馏分收集器每隔1min收集一次洗脱液。

又一方面，本发明提供上述抗菌肽在制备抗菌药物中的用途。

以下是本发明的详细描述：

根据本发明的一个具体实施方式，采用下述步骤获得目标抗菌肽：

1)从森林捕捉野生的长角血蜱(Haemaphysalis longicornis)，在试验条件下通过新西兰大白兔进行饲养。在收集血蜱唾液前，让血蜱在兔耳朵吸血120小时以上，血蜱体重达到200-300μg。