[发明专利]一种克隆山羊TNNC2基因编码区全序列的方法

权利要求书

1.一种克隆山羊TNNC2基因编码区全序列的方法，其特征在于，包括以下步骤：

A1、提取山羊眼肌组织中的总RNA，然后将总RNA反转录成cDNA；

A2、引物的设计及PCR反应：设计一对简并引物，上游引物在起始密码子的上游区域设计，下游引物在终止密码子的下游区域设计；设计的引物为：

上游引物P 1：5′-TGATGACGGACCAGCAGG-3′

下游引物P2：5′-CTTCTTACTGCACGCCCTC-3′

用cDNA为模板进行梯度PCR操作扩增TNNC2基因，温度为范围在50℃到65℃之间的8个温度点.PCR反应体系为10ul体系(5μL的2×Master Mix Tap，上下游引物各0.5μL，2μL的cDNA，2μL的ddH₂O.)，反应条件为95℃预变性5min，35个循环(94℃，40s；50℃～60℃，40s；72℃，50s)，最后72℃10min。

A3、PCR产物的回收和纯化；

A4、克隆。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤A1包括以下步骤：用液氮将眼肌磨成粉末装入1.5ml的EP管，放入零下80的超低温冰箱中备用；取新的1.5ml的EP管，加入1.3ml的Trizol液，然后加入约80mg的眼肌组织粉末，用手摇晃混匀后，用震荡仪震荡约30秒后室温放置5分钟；4℃下13000rpm离心3分钟将液体用移液枪转运到另一个新的1.5ml的EP管，加入0.2ml的氯仿，盖紧离心管，用手剧烈摇荡离心管15秒；取上层水相0.4ml于一新的离心管，加入0.4ml的异丙醇，室温放置10分钟，4℃下12000rpm离心10分钟；弃去上清液，加入1ml的75％乙醇混匀，4℃下7500g离心5分钟；小心弃去上清液，然后用移液枪吸干管壁上多余的乙醇，加入30UL到100UL的DEPC水；将效果好的RNA立即反转录成cDNA。