[发明专利]一种克隆山羊TNNC2基因编码区全序列的方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其是一种克隆山羊骨骼肌肌钙蛋白C2(TNNC2)基因编码区全序列的方法。

背景技术

快肌肌钙蛋白C2(TNNC2)是存在于骨骼肌细肌丝中的钙离子结合蛋白复合物成员之一。肌钙蛋白C与肌钙蛋白T和肌钙蛋白I一起形成三元肌钙蛋白复合物，在肌肉的收缩和舒张中起着关键作用。肌钙蛋白C2是快速骨骼肌收缩的钙离子受体，并且是钙离子激活肌小节收缩的关键。钙离子的结合启动了细肌丝褶皱般的结构的变化通过细肌丝组成蛋白。导致肌球蛋白和肌动蛋白间的横桥的变形，促使细肌丝向粗肌丝的滑动产生肌肉收缩的效果。

快肌肌钙蛋白C2含有4个钙离子结合位点，是肌钙蛋白复合物中的一个重要成员。每个钙离子结合位点均有一个由12个氨基酸残基组成的钙离子结合环，钙离子结合环存在于一对a-螺旋中。每个钙离子结合环都富含酸性氨基酸(Asp and Glu)负责结合单个钙离子。TNNC2整体结构包括一个N-末端和一个C-末端的球形区域，这两个球形区域被一个灵活的螺旋链接。从而形成哑铃形。每个球形区域包含一对EF手性结构域用于结合金属离子。

RT-PCR克隆：是将RNA的反转录(RT)和cDNA的聚合酶链式扩增(PCR)以及分子克隆相结合的技术。首先经反转录酶的作用从RNA合成cDNA，再以cDNA为模板，扩增合成目的基因片段，将合成的目的基因片段克隆到载体细胞基因中，然后用质粒PCR产物测序。此技术利用PCR技术能在体外进行有效的基因扩增，而不需要内切酶消化和连接酶处理，可利用这一技术很快获得其他依靠限制性内切酶消化的方法难于得到的PCR产物；克隆载体PCR测序能克服PCR产物测序引物近端的十几个碱基无法测序获得的缺点。与RACE(cNDA末端快速扩增)技术相比较而言，目的基因片段的长度明确，成本低，工作量小。该技术成功的关键是PCR引物的设计，在起始密码子的上游设计上游引物，在终止密码子的下游设计下游引物，使得PCR产物包含完整的基因编码区全序列。

现有技术中采用RACE(cNDA末端快速扩增)技术：是基于PCR技术基础上由已知的一段cDNA片段，通过往两端延伸扩增从而获得完整的3’端和5’端的方法。1、目的PCR产物的基因片段长度不明确。2、试验成本高。3、工作量大，实验技术要求高。

分段PCR克隆法：将目的基因分成几段来分别克隆，然后做亚克隆测序拼接。成本高，工作量大，一个基因分成几段就需要做几次克隆。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种简单、快捷的获取山羊TNNC2基因的完整编码区序列的方法，填补了该基因在山羊上的空白，为进一步研究山羊的该基因奠定了基础。

本发明采用以下技术方案：

一种克隆山羊TNNC2基因编码区全序列的方法，包括以下步骤：

A1、提取山羊眼肌组织中的总RNA，然后将总RNA反转录成cDNA；

A2、引物的设计及PCR反应：设计一对简并引物，上游引物在起始密码子的上游区域设计，下游引物在终止密码子的下游区域设计；设计的引物为：

上游引物P1：5′-TGATGACGGACCAGCAGG-3′

下游引物P2：5′-CTTCTTACTGCACGCCCTC-3′

用cDNA为模板进行梯度PCR操作扩增TNNC2基因，温度为范围在50℃到65℃之间的8个温度点.PCR反应体系为10ul体系(5μL的2×Master Mix Tap，上下游引物各0.5μL，2μL的cDNA，2μL的ddH₂O.)，反应条件为95℃预变性5min，35个循环(94℃，40s；50℃～60℃，40s；72℃，50s)，最后72℃10min。

A3、PCR产物的回收和纯化；

A4、克隆。

所述的方法，所述步骤A1包括以下步骤：用液氮将眼肌磨成粉末装入1.5ml的EP管，放入零下80的超低温冰箱中备用；取新的1.5ml的EP管，加入1.3ml的Trizol液，然后加入约80mg的眼肌组织粉末，用手摇晃混匀后，用震荡仪震荡约30秒后室温放置5分钟；4℃下13000rpm离心3分钟将液体用移液枪转运到另一个新的1.5ml的EP管，加入0.2ml的氯仿，盖紧离心管，用手剧烈摇荡离心管15秒；取上层水相0.4ml于一新的离心管，加入0.4ml的异丙醇，室温放置10分钟，4℃下12000rpm离心10分钟；弃去上清液，加入1ml的75％乙醇混匀，4℃下7500g离心5分钟；小心弃去上清液，然后用移液枪吸干管壁上多余的乙醇，加入30到100UL的DEPC水；将效果好的RNA立即反转录成cDNA。