[发明专利]一种检测脑脊液中14-3-3蛋白的方法

说明书

技术领域：

本发明涉及一种免疫检测方法，更具体地说，涉及一种检测脑脊液中14-3-3蛋白的方法。

背景技术：

克雅氏病(Creutzfeldt-Jakob disease，CJD)是一种罕见的、致命的、可传染性海绵状病毒性脑病。传统上CJD的诊断主要以临床症状和脑电图的改变为基础，但由于临床症状与其它神经系统疾病有交叉，因此，CJD的确诊需要进行脑组织病理或异常朊蛋白(PrP^Sc)检测。由于脑组织活检对于患者来讲是一种创伤性检测，同时还存在感染因子污染问题，世界卫生组织建议不宜作为常规检查手段。因此，迫切需要建立简单且特异的，脑脊液或血液的检测方法来进行辅助诊断[4]。

14-3-3蛋白是存在于多种生物体中的一种高度保守的蛋白质家族，主要分布于神经细胞中，其它组织如心、肝、肾和小肠等组织含量极少。14-3-3是一种典型的胞浆蛋白，无信号序列和跨膜片段序列[10]，分子量约为27000道尔顿(Dalton)。目前发现14-3-3蛋白至少有7种异构体(α-η)[11]，其中14-3-3β含量最高，是14-3-3蛋白家族中的主要成员，其互补脱氧核糖核酸(cDNA)编码区序列长738碱基对(base pair，bp)，编码246个氨基酸[12]。14-3-3蛋白的功能包括在钙离子/钙调蛋白依赖性蛋白激酶II存在的情况下，激活酪氨酸羟化酶和色氨酸羟化酶[12]，参与脑中氨基酸的合成等。最新报道认为14-3-3蛋白通过多种生长因子的信号转导途径，参与细胞的分化、增殖和转化[13]。正常情况下，脑脊液中检测不到14-3-3蛋白，但在一些神经系统疾病时，脑脊液中14-3-3蛋白含量增加，如人的CJD和某些病毒性脑炎以及脑血管病的急性期，而在其它痴呆性疾病中脑脊液14-3-3蛋白呈阴性。因此，结合临床症状，脑电图改变，脑脊液中14-3-3蛋白检测近年被认为是TSE(Transmissible Spongiform encephalopathies，TSE)生前有效的实验室诊断方法[14、15]。

14-3-3蛋白家族存在于多种生物体内，主要分布于神经细胞中[1]。我们的实验结果也证实，不同种属来源的脑组织提取物中存在着高丰度的14-3-3蛋白。而且抗人14-3-3蛋白抗体可与鼠、兔源的14-3-3蛋白发生交叉反应，在等量提取的的条件下，所形成阳性条带的强弱与人源的无差异，这也再次证实了该蛋白家族在不同种属间的高度保守性。

14-3-3主要为一细胞浆蛋白，分离获得天然的14-3-3蛋白纯品来制备抗体比较困难，利用基因工程技术，在体外进行表达，是越来越被人们接受的一种方法。对于14-3-3蛋白抗体的制备，国外已有利用化学方法从脑组织纯化该蛋白，与一些偶联物偶联后免疫动物，但由于该蛋白在不同种属间高度保守，因此免疫原性很差，免疫系统不能有效的识别，因此，抗体的效价都不高[10]。

所以，亟需制备出高特异性、高灵敏度的抗14-3-3蛋白抗体，并在此基础上发展一种能够准确、灵敏地检测CJD患者脑脊液中14-3-3蛋白的方法。

发明内容

本发明提供了一种检测脑脊液中14-3-3蛋白的方法。

简而言之，我们从人神经母细胞瘤细胞系中获得14-3-3β蛋白cDNA，并利用谷胱甘肽-S-转移酶(GST)融合蛋白表达系统在大肠杆菌中成功的表达了14-3-3蛋白，经亲和纯化后免疫家兔，制备14-3-3特异抗体，然后用于脑脊液中14-3-3蛋白的检测。

本发明的检测方法部分建立在本发明人制备获得了高特异性的抗14-3-3蛋白抗体。

对于14-3-3蛋白抗体的制备，国外已有利用化学方法从脑组织纯化该蛋白，与一些偶联物偶联后免疫动物，但由于该蛋白在不同种属间高度保守，因此免疫原性很差，免疫系统不能有效的识别，因此，抗体的效价都不高[10]。我们利用GST融合蛋白表达系统成功地表达了14-3-3蛋白，其表达产量高，同时具有良好的免疫反应性，表达蛋白经纯化后，用作免疫原免疫家兔，制备了高效价的14-3-3蛋白多克隆抗体，表明表达的14-3-3蛋白具有良好的免疫原性。分析其突破免疫耐受的原因可能为原核细胞表达的蛋白在翻译后的加工与真核细胞存在着差异，二者在高级结构上可能有所不同。另外，由于14-3-3蛋白与GST融合表达，其N端的GST蛋白可能影响蛋白的高级结构，但所有这些却并没有改变14-3-3蛋白的主要免疫原性和反应原性。

第一个方面，本发明成功克隆了14-3-3蛋白的编码基因