[发明专利]一种S-α-D-葡萄糖苷-L-半胱氨酸的酶促合成方法

说明书

技术领域

本发明属于生物化工领域，涉及一种S-α-D-葡萄糖苷-L-半胱氨酸的酶促合成方法。

背景技术

低聚糖复合物在生命组织各个器官的生物活动中发挥着重要作用，例如：细胞识别、细胞间的信息传递和细胞粘附过程。多肽连接上碳水化合物基团能够增加其水溶性，也可以用作靶向药物瞄准有生物活性的化合物。而半胱氨酸-SH基上连接上葡萄糖基，而成的硫代葡萄糖苷具有高的化学稳定性，在合成多肽硫代葡萄糖苷衍生物方面有很大的应用。硫代葡萄糖苷在抗癌药物上的应用近几年也在进一步扩大，导致了药物合成过程中半胱氨酸硫代葡萄糖苷在合成抗癌药物及靶向药物中有很大的应用，其需求市场正在迅速扩大。

目前，S-α-D-葡萄糖苷-L-半胱氨酸主要采用化学合成的方法获得，因为S-α-D-葡萄糖苷-L-半胱氨酸分子中有多个活性基团，包括氨基、葡萄糖基上的羟基、羧基，因此，化学合成需要对多个活性基团进行保护及脱除。Ludwig Kasbeck and Horst Kessler报道的化学合成S-α-D-葡萄糖苷-L-半胱氨酸方法是：由N-邻苯二甲酰胱氨酸衍生物，裂解成N-邻苯二甲酰半胱氨酸衍生物，在2，3，4，6-O-四-苯基-α-D-吡喃葡萄糖基三氯乙酰亚氨酸作用下将-SH糖基化，得到N-邻苯二甲酰硫代半胱氨葡萄糖苷酸衍生物，然后脱保护，得到半胱氨酸硫代葡萄糖苷(S-α-D-葡萄糖苷-L-半胱氨酸)，其主要过程如下：

1、第一步胱氨酸衍生物羧基酯化，裂解成两个半胱氨酸衍生物；

3、第三步硫代半胱氨酸葡萄糖苷衍生物的基团脱保护；

综上所述，现有的化学合成步骤较多，必须经过氨基、羟基保护与脱保护的过程，步骤复杂，污染严重，限制了其的进一步应用。近年来，人们开始利用微生物或者酶进行天然产物的生物催化合成或修饰。由于生物催化反应过程简单、条件温和、操作方便，环境污染小，能得到单一立体构型的化合物而成为许多科技人员关注的课题。目前，S-α-D-葡萄糖苷-L-半胱氨酸酶促合成直接相关的公开报道几乎没有。

发明内容

本发明所要解决的技术问题，是提供一种S-α-D-葡萄糖苷-L-半胱氨酸的酶促合成方法以克服化学合成法的缺陷。

为解决上述技术问题，本发明的思路是利用蔗糖磷酸化酶催化蔗糖和L-半胱氨酸的转葡萄糖基反应得到S-α-D-葡萄糖苷-L-半胱氨酸。

具体的技术方案如下：

一种S-α-D-葡萄糖苷-L-半胱氨酸的酶促合成方法，以含有蔗糖和L-半胱氨酸的水溶液为底物，加入蔗糖磷酸化酶，通过蔗糖磷酸化酶的转葡萄糖基反应制备S-α-D-葡萄糖苷-L-半胱氨酸。

其中，所述的蔗糖初始反应浓度为0.1～1.5mol/L，优选0.4～0.8mol/L；L-半胱氨酸初始反应浓度为0.05～0.2mol/L，优选0.1～0.2mol/L；蔗糖与L-半胱氨酸的摩尔比为4∶1～4，优选4∶1。

其中，所述的蔗糖磷酸化酶按如下步骤制备得到：

(1)以蔗糖为碳源厌氧发酵肠膜明串珠菌产蔗糖磷酸化酶；

(2)利用蛋白质分离纯化系统制备蔗糖磷酸化酶。

步骤(1)中，所述的肠膜明串珠菌为肠膜明串珠菌Leuconostoc mesenteroidesATCC12291。以蔗糖为碳源厌氧发酵肠膜明串珠菌Leuconostoc mesenteroidesATCC12291产蔗糖磷酸化酶，可参考如下发酵条件，但并不局限于该条件，根据菌株自身条件，优化发酵工艺以制备高产量的蔗糖磷酸化酶都在本发明的保护范围之内。

发酵培养基：20g/L蔗糖、10g/L大豆蛋白胨、10g/L酵母提取物、10g/L K₂HPO₄、10ml/L维生素-矿物质储液，pH 7.6。其中1L维生素-矿物质储液中含VB₁1g，VC 5g，无水硫酸镁40g，一水硫酸锰30g，七水硫酸亚铁1g。

发酵培养条件：30℃，200rpm，氮气通气量0.5vvm，厌氧发酵6～8h。