[发明专利]一种小鼠表皮总蛋白的提取方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种小鼠表皮总蛋白的提取方法。

背景技术

皮肤是机体面积最大的器官，与外界直接接触，能阻挡异物和病原体侵入，防止体液丢失，具有重要的屏障保护作用。皮肤由表皮和真皮构成，借皮下组织与深层组织相连。其中表皮暴露在机体表面，附着有灰尘、碎屑，并且表皮和真皮紧密相连、难于分离，给表皮总蛋白的提取带来了困难。而小鼠的表皮更薄，只有2～3层细胞，所以小鼠表皮总蛋白的提取更为困难。在以前的研究中，研究者通常采用小鼠全皮总蛋白进行实验分析。但真皮与表皮的细胞构成和蛋白质表达谱明显不同，在研究表皮的基因差异表达时有可能产生干扰。

发明内容

针对上述现有技术，本发明提供了一种快速有效的小鼠表皮分离、总蛋白提取的新方法，本方法简单、快速，分离的小鼠表皮量大、无真皮细胞组织搀杂，且提取的蛋白质好、纯度高，可以满足许多分子生物学实验需要。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一种小鼠表皮总蛋白的提取方法，步骤如下：

(1)取已被处死的小鼠，对其皮肤剃毛(在不损伤表皮的情况下尽量剃干净)，并用70～80％乙醇(体积分数)浸泡的棉球手术法擦拭干净；

(2)将皮肤剪下，用两片载玻片夹住，放在加热台上，热击处理；

(3)加热后，立即用眼科镊迅速地将表皮撕下，放入蛋白裂解液中；

(4)超声处理，然后在室温下放置0.5～2小时；

(5)离心，≥18000g，4℃，0.5～2小时，取上清；

(6)再次离心，≥18000g，4℃，0.5～2小时，取上清，即得小鼠表皮总蛋白，将所得上清液进行纯化或-80℃分装冻存。

所述步骤(2)中热击处理的参数为：60℃左右加热1～3分钟。

所述步骤(4)中超生处理的参数为：6秒～6秒，1～3分钟。

在动物组织的总蛋白提取中，最重要的就是防止蛋白酶的降解作用，小鼠表皮的角质层较薄，这使得小鼠表皮的蛋白质特别容易降解，另外表皮和真皮紧密相连，难于分离，目前大多数的表皮分离方法一般需要几十分钟，甚至长达数小时，使得组织中的蛋白质大量降解，使得许多分子生物学实验的不甚准确。本发明先用70～80％的乙醇擦拭小鼠皮肤，由于乙醇对蛋白质有变性和固定作用，用乙醇擦拭皮肤，一方面可以将皮肤表皮的灰尘和蛋白酶尽量擦净，另外可以将残余在皮肤表皮的蛋白酶变性。接下来将剪下的皮肤60℃热击1～3分钟，再将表皮迅速分离，这样大大缩短了蛋白酶的降解时间，从而提高了蛋白质的完整性。

本发明将热击法分离小鼠表皮和总蛋白提取方法结合起来，操作简单快速，经济适用，分离的小鼠表皮量大、无真皮细胞组织搀杂，提取的总蛋白质量好、纯度高，可以满足许多分子生物学实验比如，2-D电泳，Westenblot等的需要。

附图说明

图1为部分表皮分离皮肤的HE染色示意图；

图2为小鼠表皮总蛋白的13％SDS-PAGE(银染)示意图；

图3为Western Blot检测β-actin的表达示意图；

图4为表皮总蛋白的双向电泳检测示意图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的说明。

实施例1小鼠表皮的分离和皮肤的HE染色

将小鼠处死，背部剃毛，用70～80％乙醇浸泡的棉球手术法擦拭干净，将背部4cm²的皮肤剪下，用两片载玻片夹住，放在加热台上，60℃加热1～3分钟，用眼科镊迅速的将表皮揭开。

将小鼠皮肤浸入4％的PFA中固定20小时以上，乙醇梯度脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，9μm切片，HE染色。结果如图1所示，其中，A为部分分离的小鼠皮肤组织全景图；B为所分离后的组织，既有表皮又有毛囊；D为分离之后的真皮组织，可看到在真皮组织中没有残留的表皮和毛囊；C为未分离部分的组织对照。

结论：利用本发明分离的小鼠表皮较为完整、连续，没有真皮组织的搀杂，而且可以分离到皮肤中的完整的毛囊结构。

实施例2提取表皮总蛋白

将实施例分离的表皮放入蛋白裂解液(7M尿素；2M硫脲；4％CHAPS；65mM DTT0.5％SDS；5mM乙酸镁)中，超声(6秒～6秒，2分钟)；室温放置1小时，离心，18000g，4℃，1小时，取上清，再次离心，18000g，4℃，1小时，取上清。将样品进行纯化或-80℃分装冻存。

实施例3测定样品表皮总蛋白的浓度