[发明专利]一种嵌合病毒样颗粒疫苗及其制备方法

说明书

技术领域

本发明具体涉及一种嵌合病毒样颗粒疫苗及其制备方法。

背景技术

人乳头瘤病毒(HPV)(附图1所示)是小型DNA病毒，存在100个以上的基因型，其中有15个基因型(高危型：16、18、31、33、35、39、45、52、56、58、59、66、68、73型)是子宫颈癌的原因。HPV16型在50-60％的子宫颈癌中被检出。在欧美以18型居多，在亚洲以16、58型居多。

HPV病毒壳体为正20面体骨架上具有12分子的L2蛋白质的结构，所述正20面体骨架由72个L1蛋白质五聚体形成。L2蛋白质的两端位于病毒壳体的内部，而其N末端侧的一部分露出在壳体表面(附图2所示)。如果采用重组DNA技术仅使L1蛋白质大量表达，则会产生病毒样颗粒(Virus-like particle；VLP)。如果将牛乳头瘤病毒、棉尾兔乳头瘤病毒的VLP或L2蛋白质接种于动物，则会对病毒侵染表现出抵抗性。具体参见附图2中HPV和VLP的截面示意图。

目前，尚没有可供HPV增殖的培养细胞系。为了监测HPV的感染，制作了假病毒。在表达SV40T抗原的人293细胞中导入具有SV40复制起点的分泌性碱性磷酸酶(SEAP)表达质粒、以及L1和E7蛋白质表达质粒，则复制的SEAP表达质粒组入L1/E7-病毒样颗粒，从而形成了感染性假病毒(如附图3所示)。可以通过抑制假病毒的感染性的活性来测定中和抗体，具体参见非专利文献1(Rose，R.C.，Bonnez，W.，Reichman，R.C.，Garcea，R.L.，1993.人乳头瘤病毒11型L1蛋白质在昆虫细胞中的表达：在体内和体外组装成病毒样颗粒J.Virol.67，1936-1944)。

HPV的VLP接种于动物而得到的抗血清具有基因型特异性的中和活性。由此Merck公司开发出HPV16、18型VLP的混合疫苗，具体参见非专利文献2(Chen，X.S.，Garcea，R.L.，Goldberg，I.，Casini，G.，Harrison，S.C.，2000.来自人乳头瘤病毒16型L1蛋白质的小病毒样颗粒的结构.Mol.Cell 5，557-567.)和非专利文献3(Harper，D.M.，et al.：由一项随机对照实验得出的结果表明：一种二价L1病毒样颗粒疫苗抗人乳头瘤病毒16型和18型的效果持续达4.5年.Lancet 367(9518)，1247-1255.)。

这些疫苗在大规模临床实验中显示出基因型特异性的感染预防效果，Merck公司的疫苗于2006年取得了FDA和欧洲委员会的认证并上市销售。

如上述，如果用HPV的L1-病毒壳体免疫动物，则会诱导出极其基因特异性的免疫应答。使用16型L1-病毒壳体疫苗进行的临床实验的中间成绩显示对16型的感染的预防有效性，但也显示对于其它基因型基本没有预防效果。因此，为了用疫苗阻止子宫颈癌的发病，至少必须开发出能够抵抗所有高危型的疫苗抗原。

在15个高危HPV群体中，现在销售的HPV疫苗仅对16型和18型有效。因为VLP诱导基因型特异性的中和抗体，为了针对全部高危HPV群，必须使用15种VLP的鸡尾酒，以此作为实用性疫苗抗原是困难的。因此，希望开发诱导交叉反应性中和抗体的疫苗抗原。

专利文献1(WO2007/018049)记载的抗原是至少能够抗全部高危型的抗原，而且是基因型共有性更高的抗原。但是，其存在以下问题：专利文献1的研究中使用的感染性假病毒仅为16、18型，相对于这些感染性假病毒，专利文献1记载的抗原显示了良好的中和活性。但是，随后，本发明人针对专利文献1中的抗原对新开发的31、53、58型的感染性假病毒进行的中和实验表明，专利文献1记载的抗原抗31、52、和58型的中和活性不高。因而，开发出一种提供能够诱导抗高危型人乳头瘤病毒的交叉反应性中和抗体的疫苗抗原是目前研究的方向。

发明内容

本发明的第一个目的是提供一种嵌合蛋白质，该嵌合蛋白质通过在在人乳头瘤病毒HPV16型L1蛋白质的环部位即第140与141个氨基酸之间插入一个人乳头瘤病毒16型的E7表位而得到的。其能够制作出诱导力更强的基因型共有中和抗体的疫苗抗原，该疫苗抗原是至少能够抵抗所有高危型的抗原，而且是基因型共有性更高的抗原。

本发明的第二个目的在于提供一种由上述嵌合蛋白质聚集制成的病毒样颗粒及其制备方法。

本发明的第三个目的在于提供上述病毒样颗粒在制备人乳头瘤病毒HPV16型L1-病毒样颗粒疫苗中的应用。