[发明专利]一种从组织中分离富集靶细胞的方法

说明书

技术领域

本发明属于生物科学和药物研发领域。

背景技术

靶细胞的分离，富集在细胞学，分子生物学和免疫学方面有着广泛的应用。报导的血液循环癌细胞的临床研究结果显示，癌症患者的血液循环癌细胞的数量可以用于癌症患者的早期检测，诊断，病患的跟踪和预后等。由于癌细胞在癌症患者的血液中以极少量存在，为了能准确检测血液中的癌细胞的存在和数量，需要对血液样品中的癌细胞进行富集，以提高其检测的灵敏度和准确性。近年来，血液循环癌细胞的分离，富集越来越受到科研，临床上的重视。以乳腺癌患者为例，血液中循环癌细胞的数量与患者的临床表现有着密切的关联。在切除肿瘤组织后的最初的一段时间内，临床上就没有多少其他指标可以用来跟踪病患的病情。而乳腺癌的特点之一就是有很高的复发率，有效跟踪病患的病情，在临床上作出及时的处理，血液循环癌细胞的检测可提供一行之有效的指标。

分离富集靶细胞的方法很多。首先可以将其分为抗体依赖性和非抗体依赖性两种。非抗体依赖性方法，主要是利用细胞的物理学特性（如细胞大小，密度和重量等）来分离靶细胞。而抗体依赖性方法又分为阳性富集和阴性富集。阴性富集是把非靶细胞成分去除来达到富集靶细胞的目的。而阳性富集则是利用靶细胞的特殊标记物（一般指特异性抗原等）来富集靶细胞。近年来的报导多是用新鲜的组织样品来富集靶细胞。可是，临床上多种病理组织，细胞和正常组织，细胞等样品，多在不同状态下保存。病理切片后，对特定的细胞进行研究分析，单个细胞的DNA/RNA收集和分析，在临床研究和应用方面已很普遍，但从切片组织中收集单个细胞的DNA/RNA是不全面地，不完整的。在癌症标记物研发中，多是用癌组织与正常组织进行比较。可想而知，癌组织中也有象血管，血液细胞和其他一些正常组织，细胞等存在于癌组织中，这给研发工作带来了许多不定的因素。

发明内容

本实用新型的目的是解决上述问题而提供了一种从组织中分离富集靶细胞的方法，该方法可以从不同处理状态下的组织中分离富集靶细胞。

本发明所采用的技术方案是：

一种从组织中分离富集靶细胞的方法，包括以下步骤：

（1）将组织块在缓冲液中制备成单细胞的悬浮液；

（2）对单细胞的悬浮液进行离心处理，除去上清液，加入胰蛋白酶处理；接着加入含有10%动物血清的细胞培养基，离心处理，除去上清液；最后加入含有10%动物血清的细胞培养基，转移到试管内；

（3）向试管内加入磁珠，磁珠与悬浮液中的靶细胞相结合，在4℃或室温下培养30～60分钟；所述磁珠含有单一的靶细胞的表面抗体、细胞质内抗体或者两者都有，磁珠粒径为50nM～4.5uM，磁珠的浓度为单细胞悬浮液浓度的十分之一到五百分之一；

（4）利用磁场器械将靶细胞从细胞悬浮液中分离富集出来；

（5）加入缓冲液，清洗掉非特异性结合的非靶细胞；

（6）抽离磁场，让与磁珠结合的靶细胞从磁场中释放出来，从而得到靶细胞。

进一步地，所述步骤（2）后，经保-80℃以下或液态氮罐中保存过的样品；当需要对保存的组织进行靶细胞的分离和富集时，从液态氮罐中取出阳样品，使组织样品溶解，加入相当于试管内样品体积的5～10倍的蛋白质复性缓冲液，培养10～60分钟后，就可以用来进行靶细胞的分离和富集。

优选地，所述组织为血液、骨髓液、组织块。

优选地，所述步骤（1）缓冲液为磷酸缓冲液或不含动物血清的细胞培养液。

优选地，所述步骤（3）中表面抗体为上皮细胞粘附分子抗体，MUC1。

优选地，所述步骤（3）中细胞质内抗体为抗细胞角蛋白抗体。

更优选地，所述靶细胞包括癌细胞。

本发明具有以下优点：

本发明的方法可以从任何处理状态下的组织中分离富集靶细胞，例如从缓冲液（PBS，细胞培养基等）处理过的新鲜组织块、血液、骨髓样品等，固定液（10%福尔马林固定液、4%多聚甲醛固定液、70%乙醇固定液、100%甲醇固定液等）固定过的组织样品，低温保存（10％二甲基亚砜液氮处理液）过的活体组织中分离富集靶细胞。该方法应用范围包括分离富集，鉴定不同的靶细胞，提供纯化足够量的活的或固定过的靶细胞。利用该方法可以提高靶细胞检测的灵敏度，同时通过分离富集过程，可以收集到足够量的靶细胞，提供高纯度的靶细胞作为研究、临床诊断和分析研究的材料。同时对细胞的鉴定，准确的临床诊断以及药物研发有着非常重要的意义。

附图说明

下面结合附图和实施方式对本发明作进一步详细的说明。

图1为实施例1中经过10%二甲基亚砜处理后富集癌细胞的显微镜图；