[发明专利]鸡CRBP1基因遗传变异的检测方法和应用

说明书

技术领域

本发明涉及基因变异的检测方法，具体涉及鸡CRBP1基因遗传变异的检测方法和应用。

背景技术

单核苷酸多态性(singlenucleotidepolymorphisms，SNPs)，主要是指由基因组核苷酸水平上的变异引起的DNA序列多态性，包括单碱基的转换、颠换，以及单碱基的插入/缺失等。第1代分子标记限制性片段长度多态性(RFLP)主要研究对象是由限制性酶切位点的差异造成的DNA片段长度多态性；第2代分子标记是数目可变的串联重复序列(VNTR)，包括小卫星(minisatellite)和微卫星(microsatellite)。与前二代分子标记相比，SNPs具有以下特点：(1)数量多、覆盖密度大，据估计平均每1000bp就会出现一个。目前已检测出93％的人类基因包含SNPs，98％的SNPs其距离不超过5kb，因此，可以在几乎每个基因的内部或附近提供一系列标记；(2)由于SNPs一般只有2个等位基因，在检测时只需要通过一个简单的“+/-”方式即可进行基因分型，这使得检测、分析易于实现自动化；(3)遗传稳定性强，与微卫星等重复序列多态性标记相比，SNPs具有更高的遗传稳定性；(4)多态性丰富，SNPs包含了目前已知DNA多态性的80％以上，是最常见的遗传变异类型。基于单核苷酸多态性的上述优点，研究SNP有助于解释不同个体表形性状的差异，不同群体和个体对疾病、环境因子等反应的差异。

目前对SNP进行检测的方法较多，而大多数实验室采用的是成本相对较低、技术易掌握、检出率较高、快捷、安全和步骤简单的PCR-SSCP技术。该方法原理是：经PCR扩增的目的片段在变性剂或低离子浓度下经高温处理使之解链并确保成为DNA单链，然后在一定浓度的非变性聚丙烯酰胺凝胶中电泳。在不含变性剂的中性聚丙烯酰胺凝胶中电泳时，DNA单链的迁移率除与DNA链的长短有关外，更主要的是取决于DNA单链所形成的构象。在非变性条件下，DNA单链可自身折叠形成具有一定空间结构的构象，这种构象由DNA单链碱基决定，其稳定性靠分子内局部顺序的相互作用(主要为氢键)来维持。相同长度的DNA单链其顺序不同，甚至单个碱基不同，所形成的构象不同，电泳迁移率也不同，PCR产物变性后，单链产物经中性聚丙烯酰胺凝胶电泳，因靶DNA中发生单碱基置换，或个别碱基插入或缺失时，因迁移产生变化会出现泳动变位，从而可将变异DNA与正常DNA区分开。相同长度的单链DNA因其顺序不同或单个碱基差异，所形成的构象就会不同，其在凝胶中泳动速度不一样，从而显示出带型的差异，即多态型。

SNP有非同义cSNP、同义cSNP、内含子区SNP、调控区的rSNP几类，均能从不同角度影响基因功能，其中非同义cSNP由于改变基因编码的氨基酸，从而影响基因功能；同义cSNP可通过改变mRNA的二级结构、翻译速度等影响基因功能的发挥；内含子区SNP可通过改变剪接位点的活性来影响基因功能；调控区的rSNP则可通过影响启动子元件来调节基因的功能。

CRBP1是一类与维生素A(VA)代谢有关的疏水性小分子，担任着转运视黄醇(VA)的任务，从而参与体内许多生物学过程，如视觉、繁殖、上皮细胞的维持、骨的生长发育等。Su等(2004)以79个人组织和61鼠组织为研究材料，采用微阵列技术制作了CRBP1基因的表达模式图，其结果显示，该基因在机体表达水平表现出组织差异性，在下丘脑、子宫、卵巢、睾丸几个繁殖轴组织中均有表达，以卵巢表达量最高。RICHARD等(1996)分别采用免疫组织化学、甲硫氨酸标记亲和层析两种方法仅从小鼠子宫的间质细胞中分离CRBP1。因此研究CRBP1基因遗传变异和分子遗传特征对动物生长发育、繁殖具有重要理论意义和实践意义。

迄今为止，国内外均未见鸡CRBP1基因遗传变异的研究，由于中国地方鸡种CRBP1基因遗传变异领域的研究匮乏，该基因位点的功能研究及其遗传变异与产蛋性状(如产蛋量、开产体重、开产蛋重等)关联的研究仍是空白。

发明内容

本发明的目的在于，采用PCR-SSCP技术检测鸡CRBP1基因的单核苷酸多态性，并将其与生产性状进行关联分析，以筛选出SNP位点以辅之于育种，加快畜禽育种进程。

为了实现上述目的，本发明采取如下技术方案：

一种鸡CRBP1基因遗传变异的检测方法，其特征在于包括提取鸡血样基因组DNA；对基因组DNA进行PCR扩增，在PCR扩增时使用的上游引物序列为：TAAATTTATAGTTGCGGTCAT，下游引物序列为：AGTTCCAGGTGACGGGTGAG；将扩增产物进行凝胶电泳并拍照，分析电泳结果。