[发明专利]一种简便快速鉴别甘蓝型油菜小孢子再生的单倍体的方法

说明书

技术领域

本发明属于植物细胞学应用技术领域，具体涉及一种早期、简便、快速大批量鉴别甘蓝型油菜小孢子再生的单倍体植株的方法。

背景技术

自从上世纪八十年代末甘蓝型油菜小孢子离体培养和植株再生技术成功建立以来，甘蓝型油菜小孢子再生的双单倍体(DH)被广泛地应用于快速培育油菜新品种、构建遗传研究群体和进行遗传转化以及离体诱变等领域。实践证明，甘蓝型油菜DH技术体系是油菜遗传育种和分子生物学等研究领域的重要工具。但是，通过小孢子离体培养和双单倍体诱导后，不同的基因型或不同批次的培养材料再生的植株群体中，双单倍体株率在30％到90％以上。即小孢子通过人工染色体加倍后，不是所有基因型的再生植株都是双单倍体，而是还有约10～70％的植株是不能结种子的单倍体(Hansen et al，In vitro chromosome doubling potential of colchicine，oryzalin，trifluralin and APM in Brassica napus microspore culture.Euphytica，1996，88：159-164)。通过目测，这些无用的单倍体在开花前不能与双单倍体区分，尤其是在试管苗阶段。研究人员只能将小孢子再生的各种倍性植株同时栽到温室或者田间，到现蕾或初花期阶段，将单倍体植株砍掉不要。或者用秋水仙碱涂抹单倍体植株的顶芽和腋芽进行染色体加倍。或者把该植株从土中挖出来，洗净根部的泥土，用秋水仙碱溶液浸泡根后，再栽到土中，使之染色体加倍。此时识别和处理单倍体植株必然提高了人工、试剂等费用，而且染色体加倍太晚，推迟了成熟期。另外，在我国长江流域，甘蓝型油菜小孢子离体培养后于每年6月份形成完整植株。而此时已不是油菜种植季节，小孢子再生的植株不能移栽到田间。而且国内一般均没有控温控湿的自动化温室，这些植株只能于试管继代培养到10月中旬以后才能移栽到田间。对大量未能识别的单倍体植株进行多次继代，需要大量试剂和人力，移栽到田间需要一定量的土地和肥料等费用(见表2)。在蕾期或初花期，把单倍体植株从土中挖出，经秋水仙碱处理后，再栽到田间。一般重栽的植株在10天后才能恢复生长，延迟成熟期约2周。这不但使DH技术的应用成本提高，而且效率降低。因此，急需一种于甘蓝型油菜小孢子植株发育早期能简便、快速准确鉴别单倍体的方法。