[发明专利]一种重组免疫毒素CCL25-PE38基因及制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，更具体涉及一种抗CCR9⁺白血病的重组免疫毒素CCL25-PE3基因，同时还涉及一种抗CCR9⁺白血病的重组免疫毒素CCL25-PE38的制备方法，还涉及重组免疫毒素CCL25-PE38基因的用途。

背景技术

研究发现CCR9在急性T淋巴细胞性白血病(T-ALL)患者的CD4⁺T淋巴细胞上异常高表达，CCR9的配体CCL25在淋巴结和皮肤中表达水平显著增高。在CCR9发生内置的情况下，白血病细胞的趋化和粘附作用减弱，说明CCR9与白血病细胞的迁移运动密切相关。CCR9的天然配体CCL25可以诱导T-ALLCD4⁺T细胞依赖Livin的方式抵抗TNF-α诱导的凋亡，说明CCL25/CCR9对T-ALL的存活有着十分重要的促进作用。

另有报道，在儿童ALL复发患者中，白血病细胞高表达CCR9和CD103，并且浸润到患者肠内的白血病细胞仍然高表达CCR9，同时高表达CCL25。说明CCL25/CCR9与儿童ALL病复发及白血病细胞转移至特定部位密切相关。成人淋巴细胞白血病(ALT)是一类具有高度侵袭性的CD4⁺成熟淋巴细胞恶性肿瘤，表达HTLV-1编码的转录因子Tax的白血病细胞可表达CCR9，体外培养ALT细胞1天后，可检测到CCR9在大多数白血病细胞上表达，使用免疫组织化学检测到侵入胃肠道的CD4⁺T细胞普遍表达CCR9，表明白血病细胞浸润到患者肠内与CCR9的表达密切相关。以上研究提示趋化因子及其受体在不同的白血病及其亚型表达谱不同，极有可能成为白血病靶向治疗的潜在位点。

免疫毒素的毒蛋白分为两类：一类是植物毒素如蓖麻毒素、美洲商陆抗病毒蛋白等，另一类是细菌毒素如绿脓杆菌外毒素(Pseudomonas exotoxin，PE)、白喉毒素等。PE38是PE的衍生物，其结合细胞表面受体的结构域被去除，保留了羧基端的ADP核糖基化酶功能结构域，通过导向分子进入细胞后最终在细胞质中与肽链合成中的延长因子EF-2结合，使EF-2糖基化失活，蛋白合成被阻断，从而导致细胞凋亡。

目前还没有使用毒素蛋白PE38靶向CCR9受体这一靶点的重组免疫毒素肿瘤治疗技术方案报道。

发明内容

本发明的目的是在于提供了一种重组免疫毒素CCL25-PE38基因。该基因具有SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。该序列SEQ ID NO.3是首次克隆，根据该序列可以设计引物，通过PCR的方法扩增获得该基因序列。

本发明的另一个目的是提供了一种抗CCR9⁺白血病的重组免疫毒素CCL25-PE38基因制备方法。该方法是构建真核分泌表达载体，转染真核细胞表达该重组免疫毒素，利用亲和层析方法纯化重组免疫毒素CCL25-PE38。该方法简便，表达的重组免疫毒素活性高。

本发明的再一个目的是提供了一种重组免疫毒素CCL25-PE38基因在制备治疗或预防急性T淋巴细胞白血病药物中的应用。该免疫毒素能特异性结合并杀伤CCR9⁺急性T淋巴细胞白血病(T-ALL)MOLT4细胞，延缓MOLT4细胞异种移植肿瘤的生长，实现了有效治疗特定类型白血病的目的。

为了实现上述的目的，本发明采用以下技术措施：

术语“CCL25-PE38”包括完整的CCL25、PE38、His标签及CCL25与PE38之间的连接序列(Linker，(SG₄)₄)，如SEQ ID NO.3所示核酸序列，SEQ ID NO.4所示氨基酸序列。

一种抗CCR9⁺白血病的重组免疫毒素CCL25-PE38基因制备方法，其步骤是：

A、钓取CCL25(GenBank：BC144463.1)的cDNA，通过合成多对可互扩的引物(A和B、C和D、E和F、G和H、I和J)，先合成较短的基因片段(AB、CD、EF、GH、IJ)，AB和CD、CD和EF、EF合GH、GH和IJ之间存在着互相重叠的区域。采用SOE-PCR，如分子免疫学实验指南(黎燕等编著，2008，北京，化学工业出版社)所述的方法，构建CCL25的cDNA(图1)。