[发明专利]一种重组免疫毒素CCL25-PE38基因及制备方法和应用

权利要求书

1.一种分离的重组免疫毒素的质粒，其特征在于：重组免疫毒素序列为SEQ ID NO.3所示核苷酸序列。

2.一种分离的蛋白质，其序列为SEQ ID NO.4所示氨基酸序列。

3.权利要求1所述的一种抗急性T淋巴细胞白血病的重组免疫毒素CCL25-PE38基因制备方法，其步骤是：

钓取CCL25的cDNA, 通过合成互扩的引物：A和B、C和D、E和F、G和H、I和J，先合成较短的基因片段：AB、CD、EF、GH、IJ，AB和CD、CD和EF、EF合GH、GH和IJ之间存在着互相重叠的区域，构建CCL25的cDNA；

钓取 PE38的cDNA，运用PCR从pRB391质粒为模板，使用上游引物K，和下游引物L进行PCR，克隆PE38的cDNA；

构建Igκ-CCL25-PE38，以CCL25 步骤（1）获得的PCR产物)为模板，合成Igκ-CCL25-linker，以PE38步骤（2）获得的PCR产物为模板，合成Linker-PE38，采用SOE-PCR，合成Igκ-CCL25-PE38全基因片段；

构建pcDNA3.1-CCL25-PE38真核分泌表达载体，分别用核酸内切酶Hind Ⅲ和 EcoR Ⅰ消化PCR扩增产物Igκ-CCL25-PE38和pcDNA3.1载体，然后连接构成CCL25-PE38的真核分泌性表达质粒；

（5） 制备免疫毒素CCL25-PE38：pcDNA3.1-CCL25-PE38质粒转染293T细胞，采用无血清培养基OPTI-MEM 进行培养，72小时后收获细胞培养上清；使用HisTrap FF进行纯化，使用BCA法进行测定蛋白浓度，结果显示重组免疫毒素CCL25-PE38浓度为2 nmol/ml；Western blot鉴定所表达的重组免疫毒素，结果显示重组免疫毒素CCL25-PE38，能被抗PE38的抗体特异性识别，并与预期目的分子量54.7 kDa条带一致。

4.权利要求1或2所述的一种分离的重组免疫毒素的质粒在制备治疗或预防急性T淋巴细胞白血病药物中的应用。