[发明专利]去氢甲睾酮多克隆抗体免疫亲和柱的制备方法及其应用

说明书

技术领域

本发明属于免疫亲和层析及兽药残留检测技术领域，涉及去氢甲睾酮多克隆抗体免疫亲和柱的制备方法及其应用。

背景技术

去氢甲睾酮（1-dehydro-17-methyltestosterone, DMT），是一种蛋白质同化雄性类固醇激素。由于其具有强烈的促进蛋白合成、增强食欲、提高饲料转化率等作用，常被非法用于畜牧生产领域。DMT被人体吸收后，会干扰人体自身的激素平衡，产生严重的毒副作用。

目前，DMT常用的检测方法多为仪器检测方法，如高效液相色谱（HPLC）、液质联用（LC-MS）和气质联用（GC-MS）等。这些仪器检测方法对样品纯度要求较高，需经过一定的前处理，而传统的样品前处理技术，如液-液萃取（LLE）、固相萃取（SPE）、固相微量萃取（SPME）等，步骤繁琐、缺乏选择性、容易受其他成分的干扰、准确度低。因此，建立快捷有效的样品前处理技术已成为DMT检测分析中需解决的首要问题。

免疫亲和色谱(IAC)是一种新型高效的样品前处理技术。它的原理是利用抗原抗体间特异性的可逆结合来实现对复杂样品中的目标物质的提取和净化处理。近年来，免疫亲和色谱技术结合常规仪器分析已成为兽药残留检测的一个主要发展方向。但目前尚未见DMT多克隆抗体免疫亲和柱的制备及其使用的报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种DMT免疫亲和柱的制备与使用方法，所研制的亲和柱是将DMT多克隆抗体与溴化氰活化的琼脂糖4B（CNBr-Sepharose 4B）偶联填充于固相萃取管中，用于纯化含有DMT的待测样品。

本发明所述的DMT多克隆抗体免疫亲和柱的制备方法，按照下述步骤进行制备：

（1）偶联：取免疫动物并经纯化的DMT多克隆抗体与溶胀后的CNBr-Sepharose 4B湿凝胶置于偶联缓冲液中在室温下振荡偶联；

（2）封闭：将偶联凝胶产物转入其5-10倍体积的封闭缓冲液中，室温下振荡反应2 h；

（3）洗涤：先分别用5-10倍封闭后凝胶体积的醋酸盐缓冲液和Tris-HCl缓冲液交替洗涤3次，然后用5-10倍封闭后凝胶体积的PBS缓冲液洗涤2次，制备得到免疫亲和吸附剂；

（4）装柱：将得到的免疫亲和吸附剂填充入固相萃取管中，加入PBS缓冲液后自然沉降，制成DMT多克隆抗体免疫亲和柱，于4 ℃保存待用；

其中步骤（1）中所述的DMT多克隆抗体与CNBr-Sepharose 4B干胶的质量比为1:100；所述的偶联缓冲液为pH 8.3、含0.5 mol/L NaCl 的0.1 mol/L NaHCO₃偶联缓冲液；所述的溶胀CNBr-Sepharose 4B的溶液为1 mmol/L HCl溶液；

其中步骤（2）中所述的封闭缓冲液为pH 8.0、含0.5 mol/L NaCl 的0.1 mol/L Tris-HCl封闭缓冲液；

其中步骤（3）中所述的醋酸盐缓冲液为pH 4.0、含0.5 mol/L NaCl的0.1 mol/L 醋酸盐缓冲液；所述的Tris-HCl缓冲液为pH 8.0、含0.5 mol/L NaCl的0.1 mol/L Tris-HCl缓冲液；所述的PBS缓冲液为pH 7.4、0.01 mol/L的PBS缓冲液；

本发明去氢甲睾酮多抗免疫亲和柱的应用，可以应用于去氢甲睾酮的快速检测。

本发明的有益效果：（1）本发明制备的免疫亲和柱能够与DMT特异性结合，一次净化能除去绝大部分干扰物，能得到纯度较高的DMT。（2）制备的免疫亲和柱最大结合容量约为160 ng DMT；(3) 采用的洗脱液为80 %的甲醇-水溶液时，平均加标回收率为97.87 %；（4）制备的免疫亲和柱重复使用3次，回收率不低于90 %。

附图说明

其中图1. 本发明IAC柱外观图；

图2. 本发明IAC柱洗脱条件选择优化图；

图3. 本发明IAC柱最大结合容量图；

图4. 本发明IAC柱icELISA评价方法标准曲线图；

图5. 本发明IAC柱HPLC评价方法标准曲线图。

具体实施方式

本发明下面的实施例仅作为本发明内容的进一步说明，不能作为本发明的限定内容或范围。下面通过实施例对本发明作进一步说明。

实施例1 DMT多抗免疫亲和柱的制备

（1）    偶联