[发明专利]一种叶片组织自由基测定的原位显色和定量的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种叶片组织的原位显色和定量的方法，更具体的说是一种叶片组织自由基测定的原位显色和定量的方法。

背景技术

植物组织的光合作用、呼吸、氧化磷酸化、脂肪酸的-?-氧化以及许多氧化酶的代谢过程均可产生活性氧自由基（统称为ROS）。愈来愈多的研究报道，ROS是植物体代谢的正常部分，可作为信号分子诱导植物体对环境胁迫的应激响应，而过量ROS的积累却能诱导膜脂质过氧化、蛋白分子的氧化修饰或降解，以及DNA分子的氧化损伤等。因此，研究自由基的产生、积累和代谢的变化，能够反映植物体在逆境条件下的氧化胁迫和应激响应水平，可为环境污染物的早期诊断提供预警信号。因此，准确测定植物组织ROS的产生和积累水平具有十分重要的理论意义和应用前景。

植物体内的ROS通常存在超氧阴离子自由基（O₂^.-）、过氧化氢（H₂O₂）、羟基自由基（OH^.）、单线态氧(¹O₂)等类型，其中产生最早的是O₂^.-，氧化能力最强的是OH^.。这些ROS类型可以形成一个复杂的反应网络，通过协同作用相互转化。例如，O₂^.- 和H₂O₂可通过Fenton反应、Haber-Weiss 反应、Winterbourn反应以及光解反应等过程转换成OH^.。ROS的测定方法通常包括分光光度法、原位显色法、自旋捕捉-电子顺磁共振法（EPR）、流式细胞仪测定等方法。其中关于植物体O₂^.-和H₂O₂的研究报道最多,也最受到关注。

自由基的半衰期十分短暂，而且在植物体内的存在浓度很低，直接捕捉十分困难。因此，人们常常应用间接方法去检测植物体内产生O₂^.-的速率。王爱国和罗广华^[1]应用植物匀浆液的羟胺反应产生O₂^.-的中间产物，再应用分光光度法测定和推算植物体内O₂^.-的产生速率。Able AJ^[2]应用四唑类化合物捕捉人工培养的烟草细胞内的O₂^.-，应用分光光度法测定O₂^.-中间产物的含量。这两种方法都是测定植物体产生O₂^.-速率的间接方法,被广泛引用。

植物组织的O₂^.-也能够直接捕捉和定量。有研究报道，特异性捕获剂结合EPR-自旋捕捉技术是检测生物和化学体系中O₂^.-产生量的最直接和最敏感的技术。O₂^.-的特异性捕获剂phenyl-N-t-butylnitrone （PBN）能够与O₂^.-迅速结合并形成稳定的中间产物，再结合EPR-自旋捕捉技术就能够克服O₂^.-存在周期短暂而不易捕捉的局限性，能够对O₂^.- 进行定性和定量分析^[3]。然而这种方法所应用的设备十分昂贵，而且同一种捕获剂对不同的植物也具有其特异性，因此，限制了推广。