[发明专利]一种叶片组织自由基测定的原位显色和定量的方法

权利要求书

1.一种叶片组织自由基测定的原位显色和定量的方法，其步骤为：

第一步：采集植物新鲜叶片，快速漂洗干净；

第二步：叶片自由基显色反应；

第三步：脱除叶片叶绿素，清洗叶片并扫描成像用于软件分析定量。

2.根据权利要求1所述的一种叶片组织自由基测定的原位显色和定量的方法，其特征在于：同步设置对照组，根据所测自由基种类不同，在第二步前对对照组叶片前处理方法分别为1）超氧阴离子自由基：将叶片置于真空抽滤装置内，加入含10~20 U/mL SOD酶和10 mM MnCl₂的溶液，抽真空3次，每次3~5 min，效果以叶片表面冒出明显气泡为宜；2）过氧化氢自由基：将叶片置于真空抽滤装置内，加入含10 mM 抗坏血酸和1~2 mM过氧化氢酶的溶液，抽真空3次，每次3~5min，效果以叶片表面冒出明显气泡为宜。

3.根据权利要求1或2所述的一种叶片组织自由基测定的原位显色和定量的方法，其特征在于第二步具体为：将预处理过的对照组叶片和未处理待测叶片置于真空抽滤装置内，根据所测自由基种类不同，按如下处理1）超氧阴离子自由基：应用0.5~1.0 mg/mL氮蓝四唑NBT溶液抽真空3次，每次5~10 min；2）过氧化氢取自由基：立即应用1~2 mg/mL二氨基联苯胺DAB溶液抽真空3次，每次5~10 min；抽滤结束后，将叶片连同溶液置于暗处，静置5~12 h，使其充分显色。

4.根据权利要求3中任一项所述的一种叶片组织超氧阴离子和过氧化氢自由基测定的原位显色和定量的方法，其特征在于第三步具体为：显色反应结束后，用镊子将叶片从溶液中小心取出，洗去表面残余溶液，置于煮沸的80%的乙醇溶液（v/v）中，溶液加入沸石注意防止暴沸，并注意在整个过程中补充因挥发损失的乙醇溶液；以叶片组织完全失绿并变得透明，可见自由基反应色斑时停止加热；叶片超氧阴离子自由基与NBT反应呈蓝色斑点，过氧化氢自由基与DAB反应呈棕褐色斑点；用纯水冲洗叶片后，扫描成像，应用图像处理软件Image-Pro plus软件对自由基着色区域进行光密度统计分析；叶片可置于10%的甘油(v/v)中，4℃下长期保存备用。

5.根据权利要求3中任一项所述的一种叶片组织自由基测定的原位显色和定量的方法，其特征在于对照组预处理所用的溶液以及显色反应所用的NBT和DAB溶液均用10 mM 磷酸缓冲溶液PBS配制，pH值保持在6.5~7.5。