[发明专利]新的超灵敏的基于细胞的传感器及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及新的基于细胞的传感器，其有效用于药物发现，诊断和测定分析物，所述基于细胞的传感器包括具有分泌颗粒的专职受控胞吐作用的细胞系，所述细胞系用作为报道分子多肽的存储在具有专职受控胞吐作用的细胞系的受控分泌颗粒中的蛋白酶转染，并具有作为受控分泌颗粒胞吐作用调节剂的内源或异源分子，所述颗粒存储的蛋白酶报道分子至少具有：针对颗粒内已经存在的条件诸如低pH和其他蛋白酶的蛋白水解作用的高度抗性；胞吐作用后的酶活性；高度特异性切割序列；在无刺激或基础条件下非常低的分泌水平；和在与细胞培养物生存力和颗粒胞吐作用相容的培养基中高信号与背景活性比，以获得高通量的可靠且灵敏的检测。

当基于细胞的传感器使用胞吐作用调节剂的特异性配体温育时，报道分子多肽由颗粒释放至胞外培养基中并且这些释放的报道分子多肽的酶活性使用特异性底物来检测。本发明还容许开发多重测定，其通过在同一反应器中混合至少两种细胞系(各细胞系具有不同的成对的胞吐作用调节剂-颗粒存储的蛋白酶报道分子)和使用各颗粒存储的蛋白酶报道分子的高特异性底物来检测胞吐作用来进行。

这些灵敏的基于细胞的传感器有效用于测试至少两个分子之间的相互作用，一个分子担当胞吐作用调节剂且另一个担当胞吐作用调节剂的特异性配体。所述传感器的应用的实例是：为了测试药物发现中分子间相互作用，为了定量分子诸如蛋白从而诊断和检测例如食品工业中、环境样板中和制药工业中数种样品中的药物或分子。

发明背景

发现新的治疗剂的方法传统上涉及以下阶段：在患者中或在合适的模型系统中，(1)鉴定药物靶标，(2)验证所述靶标，(3)筛选影响靶标活性的化合物，(4)测试前导化合物毒性，(5)测试前导化合物副作用，和(6)检验前导化合物的代谢和稳定性。

高通量筛选(HTS)是药物发现过程的最初阶段之一。其容许测试数十万化学化合物/日，从而选择最卓越的候选者进行未来的检验。化合物针对治疗靶标进行测试。近期现代大规模筛选的发展受到由基因组学鉴定的数量越来越多的靶标和利用组合化学方法合成的化合物文库的扩大的高度影响。

例如，质膜接纳超过20种不同的受体家族，包括超过1000种不同的蛋白，其被称为受体组(receptorome)。G-蛋白偶联受体(GPCR)超家族代表受体组的单个最大部分，尽管受体组还包括toll样受体、整联蛋白受体、低密度脂蛋白受体、蛋白酪氨酸激酶受体和磷酸酶、细胞因子受体和甚至一些起受体作用的离子通道。

胞外和细胞表面受体之间的相互作用的治疗开发，其作为“药物-受体”概念发起，被认为是20世纪生物医学科学中的重大思想和见解之一。由于靶标鉴定的持续进步，筛选技术和靶标验证，基于受体组的药物发现努力可能在未来数十年中具有生产价值。毫不意外地，大多数专家断定受体组占可药用基因组的最大部分，其中GPCR始终引领该团体。

最初的大规模筛选技术之一是竞争性放射性配体结合测定，其依赖于选择性靶向目的受体的高度特异活性放射性配体的使用。竞争性放射性配体结合测定，在典型地进行时，提供关于特定分子靶标的药物亲和性的可靠评估，但是不提供关于功效(作为激动剂、拮抗剂或部分激动剂)的信息。传统上，药理学家已经依赖竞争性放射性配体结合测定来测量配体亲和性和受体特异性，并将生理学相关性归因于GPCR。竞争性放射性配体筛选经得起近-HTS(near-HTS)技术的检验，因为它们可以在96+孔板中进行，这已经被证实对于有效筛选针对受体阵列的受关注化学品文库具有无法估计的价值。竞争性放射性配体结合测定还有助于使化学结构与药物副作用相联系。

即使放射性配体筛选在不同细胞表达系统之间是一致的，它们具有数种缺点，这些缺点使得研究转向另外的技术。例如，放射性配体测定不区分激动剂、部分激动剂、拮抗剂和反激动剂。但是更重要地，放射性配体测定不能检测配体结合下游发生的响应，并且同样不适合使孤独受体脱孤(deorphanizing)，这是因为，通过定义，这些oGPCR具有未知的配体。另外，放射性配体结合测试，典型地，对于检测与内源受体位点(正构位点，orthosteric site)结合的配体具有偏差并因此可能不能检测在与内源位点不同的位点，即变构位点处发挥其作用的小分子调节剂。