[发明专利]新的超灵敏的基于细胞的传感器及其应用

权利要求书

1.基于细胞的传感器，其包括：

a具有分泌颗粒的专职受控胞吐作用的造血细胞系，

b蛋白酶报道分子，其转染到(a)所述细胞系中，存储在所述细胞系的分泌颗粒中，

c(a)所述细胞系的分泌颗粒的受控胞吐作用的内源性调节剂或转染的异源性调节剂，

d用于检测所述分泌颗粒存储的蛋白酶报道分子的特异性底物。

2.权利要求1的基于细胞的传感器，其中所述具有分泌颗粒的专职受控胞吐作用的细胞系是造血细胞系和/或它们的后代，其选自由髓样细胞系组成的组，或选自由淋巴样细胞系组成的组，所述髓样细胞系包括单核细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞、肥大细胞、红细胞、巨核细胞、血小板和树突细胞，所述淋巴样细胞系包括T-细胞、B-细胞和NK-细胞。

3.权利要求1-2的基于细胞的传感器，其中所述细胞选自由以下各项组成的组：大鼠嗜碱性白血病细胞系RBL-2H3、小鼠骨髓造血细胞系32D、天然杀伤细胞系人NK92细胞系、天然杀伤细胞系人YT细胞系和小鼠肥大细胞小鼠MC/9细胞系。

4.权利要求1-3的基于细胞的传感器，其中所述胞吐作用调节剂是多肽，所述多肽在被活化或抑制时诱导胞内钙、cAMP、二酰甘油(DAG)磷脂或ATP水平变化，其转而控制或调节钙触发的胞吐作用。

5.权利要求1-4的基于细胞的传感器，其中所述受控分泌颗粒胞吐作用调节剂是内源性表面受体或转染的异源性表面受体。

6.权利要求5的基于细胞的传感器，其中所述表面受体选自由以下各项组成的组：G-蛋白偶联受体(GPCR)、携带ITAM基序的受体、携带ITIM基序的受体和蛋白酪氨酸激酶受体。

7.权利要求1-6的基于细胞的传感器，其中所述受控分泌颗粒胞吐作用调节剂是嵌合受体，其包括：(a)具有配体结合结构域的胞外区和(b)包含ITAM序列的Fc受体的至少跨膜和胞内区，用于在胞外区配体结合诱导受体寡聚化之后增加胞内钙。

8.权利要求1-7的基于细胞的传感器，其中稳定转染至所述细胞系中并存储在所述分泌颗粒中的蛋白酶报道分子是多肽，所述多肽对造血细胞颗粒内部的蛋白质水解和低pH环境具有抗性。

9.权利要求8的基于细胞的传感器，其中稳定转染至所述细胞系中的、由分泌颗粒存储的蛋白酶报道分子是丝氨酸蛋白酶。

10.权利要求9的基于细胞的传感器，其中丝氨酸蛋白酶选自由天然存储在造血细胞颗粒中的丝氨酸蛋白酶组成的组，包括具有在天冬氨酸后切割的天冬裂酶样活性的酶；具有在苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸后切割的胃促胰酶-样活性的酶；具有在赖氨酸或精氨酸后切割的类胰蛋白酶-样活性的酶或具有在缬氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、亮氨酸或半胱氨酸后切割的弹性蛋白酶-样活性的酶。

11.权利要求8-10的基于细胞的传感器，其中所述丝氨酸蛋白酶是选自由以下各项组成的组的粒酶：人粒酶A、B、H、K和M、鼠粒酶A、B、C、D、E、F、G、K、M、L和N；牛粒酶B、黑猩猩粒酶B、短尾负鼠粒酶B和马粒酶B。

12.权利要求8-10的基于细胞的传感器，其中所述丝氨酸蛋白酶选自人胃促胰酶、人组织蛋白酶G、人嗜中性粒细胞弹性蛋白酶和人蛋白酶3。

13.权利要求1-12的基于细胞的传感器，其中所述颗粒存储的蛋白酶报道分子是来自人、大鼠、黑猩猩和/或马物种的粒酶B，且用于检测报道分子胞吐作用的底物包括处于P4的选自异亮氨酸或缬氨酸的氨基酸；处于P3的选自谷氨酸、甲硫氨酸、丙氨酸、甘氨酸、组氨酸、丝氨酸、谷氨酰胺、天冬氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸或缬氨酸的氨基酸；处于P2的选自脯氨酸、苏氨酸、谷氨酰胺、天冬氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸、色氨酸、酪氨酸、缬氨酸、谷氨酸、甘氨酸或组氨酸的氨基酸，和处于P1的天冬氨酸。

14.权利要求13的基于细胞的传感器，其中所述底物还包括处于P1`的选自缬氨酸、丝氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸的不带电氨基酸和处于P2′的选自丝氨酸、丙氨酸、甘氨酸、酪氨酸、亮氨酸或谷氨酸的氨基酸。