[发明专利]用于诱变检测的测定法

说明书

关于联邦资助研究的声明

本发明部分由国立卫生研究院(National Institutes of Health)授予的AI067769号基金资助。政府在本发明中具有一些权利。

相关申请的交叉引用

本申请要求于2009年11月30日提交的申请号为12/627,985的美国申请的优先权。该专利申请还涉及于2008年5月28日提交的国际申请号为PCT/US08/64985的国际申请，该申请要求于2007年5月29日提交的申请号为60/940,633的美国临时专利申请的权益，所有这些申请的全部内容通过援引加入本文中。

技术领域

本发明涉及诱变测定法和可用于其中的细胞和试剂盒。

背景技术

公认化学剂的诱变潜力大致与该化学剂的致癌潜力大概成比例。早期确定特定试剂是否存在诱变性的危害对于开发用于化学、化妆品、食品添加剂和制药工业的产品开发是至关重要的。

诱变剂是导致突变率(即，生物体的遗传物质中可检测和可遗传的结构改变)提高的试剂。这种改变可以包括整个染色体的添加或缺失，染色体的结构改变(例如，易位)以及一部分基因组序列的结构改变(例如，点突变、多个连续核苷酸的突变和部分基因组序列的缺失)。由于遗传改变可以损害或以其他方式干扰基因的作用，诱变剂被表征为基因毒素，即，对基因有毒性的作用剂。

发明内容

本发明提供了一种包含营养缺陷型基因的构建体，所述营养缺陷型基因被生色酶(colorigenic enzyme)基因破坏，所述生色酶基因被编码选择标记的多核苷酸破坏。在一个实施方案中，所述营养缺陷型基因包括His3基因。在另一个实施方案中，所述选择标记包括Ura3基因。在又一个实施方案中，所述构建体包括质粒。在一个实施方案中，所述构建体被重组引入至宿主细胞基因组中。还在另一个实施方案中，所述生色酶基因包括LacZ。还在另一个实施方案中，所述构建体包含选自由下列各项组成的组的序列：(a)SEQ ID NO：1；(b)与SEQ ID NO：195％相同的序列；(c)(a)或(b)的互补体；以及(d)(a)、(b)或(c)的序列，其中T可以是U。

本发明还提供了一种被重组改造为包含上述构建体的宿主细胞。在一个实施方案中，所述宿主细胞是真核细胞。在另一个实施方案中，所述宿主细胞是酿酒酵母。

本发明还提供了一种表征试剂的诱变性的方法，包括使包含上述构建体的宿主细胞与试剂接触，并测量β-半乳糖苷酶的活性，其中与对照相比β-半乳糖苷酶活性的提高指示试剂具有诱变潜力。

本发明提供了一种表征测试试剂的方法，包括：用测试试剂处理包含DEL选择标记的真核细胞；以及在用所述测试试剂处理所述真核细胞后测量线粒体活性。在一个方面，本发明利用MTT或MTS试剂来检测线粒体活性。在另一个方面，所述细胞是酵母细胞。

本发明提供了一种表征测试试剂的方法，包括：提供包含DEL选择标记的真核细胞培养物；用或不用测试试剂处理所述真核细胞培养物；在合适的选择培养基存在的情况下测量所述细胞培养物的被处理部分的线粒体活性；以及在所述选择培养基存在的情况下测量所述细胞培养物的未处理部分的线粒体活性。在一个方面，本发明利用MTT或MTS试剂来检测线粒体活性。在又一个方面，所述细胞是酵母细胞。

本发明还提供了一种包含细胞和线粒体活性检测试剂的试剂盒，所述细胞包含DEL选择标记。

在下面的附图和说明书中列举了本发明的一个或多个实施方案的细节。从说明书和附图以及权利要求书中，本发明的其他特征、目的和优点将是显而易见的。

附图说明

图1显示了通过向-His培养基中的100,000个本底RS112细胞添加不同稀释度的RS112His⁺回复体来模拟DEL测定。对12、18和24小时时间点作图。在第12小时，对应于每10,000个细胞25、50和100次DEL事件的RS112His⁺添加可感知地显著。到了第18和24小时，均可明显地检测到每10,000个细胞少至2.5次DEL事件。而在第24小时，尽管25-1000个RS112细胞仍然与本底显著不同，但在-His培养基中的生长变得饱和并且丧失反应模式。对于每个处理组使用至少6次重复来进行实验，并且结果表示为均值±SD。显著性*(p＜0.05)。