[发明专利]用于CD34-阴性干细胞的扩增培养基

说明书

本申请要求2009年12月23日提交的申请号为61/289,796的美国临时申请的优先权，其全部内容通过引用并入本文。

本申请通篇引用了不同的出版物。这些出版物的公开内容在此通过引用并入本申请，以便更全面地描述本发明涉及的技术现状。

发明背景

来源于骨髓和脐血的人类非造血干细胞越来越多地被用作用于患者的再生和免疫调节指征的间充质细胞。在全球范围内已经利用间充质干细胞实施了超过80例临床试验。

几乎所有的研究人员都使用含胎牛血清(FBS)的培养基作为标准血清补充物。FBS是牛源的，可以传播TSE(即可传播性海绵状脑病)和刺激接受者的免疫应答。只有无BSE的牛被权威机构核准用于人类(新西兰)，研究人员正努力研发用于促进细胞生长的替代方法。由于细胞疗法很可能在未来几年将被越来越多地使用，随之而来的将是FBS的短缺。

一些公司已经研发了无血清培养基。但是这些培养基显示出比理想的生长速率低的生长速率，骨髓源性CD34-阴性干细胞的形态和性质在这些培养基中不能如在含FBS培养基中那样广泛表征。

人类凝血细胞(即血小板)已经被其他研究人员用作新鲜冰冻血浆(FFP)，用作促生长成分。血小板及其用于再生医学的潜在意义由Stellos和Gawaz，以及Langer和Gawaz分别评述。

关于使用血小板或FFP的干细胞扩增可提及本领域的下列具体教导。Schallmoser等人公开了使用血小板裂解物的间充质干细胞扩增。Capelli等人公开了未过滤的人类血小板裂解物用于扩增和生产间充质基质细胞的用途。Kocaoemer等人公开了人类AB血清和凝血酶激活的富血小板血浆在扩增来自脂肪组织的间充质干细胞中的用途。Muller等人公开了用于分离和扩增来自人类骨髓的多潜能间充质基质细胞的无动物血清培养条件，所述条件使用FFP和血小板两者。Blande等人公开了脂肪组织间充质干细胞在无动物血清培养基中的扩增，所述无动物血清培养基中补充有已经无菌过滤的人自体血小板裂解物。而且，Salvadè等人公开了血小板裂解物在培养间充质基质细胞中的用途，其中所述裂解物是无菌过滤的。

尽管血小板裂解物和FFP用于培养间充质干细胞的已知用途，仍然存在未满足的需求，即更快速、更低廉和更安全地以稳定方式培养这种细胞，同时保留其以后在需要时进行分化的能力。

发明内容

本发明提供了一种细胞生长培养基，其包含：

(a)无直径大于0.22μm的固体物质的人类血小板裂解物，其中所述裂解物构成所述细胞生长培养基的总体积的2％至15％；

(b)无直径大于0.22μm的固体物质的人类新鲜冰冻血浆(FFP)滤出物，其中所述FFP滤出物构成所述细胞生长培养基的总体积的1％至10％；

(c)浓度为所述细胞生长培养基的0U/ml至10U/ml的肝素；

(d)浓度为0.5mM至10mM的L-谷氨酰胺；和

(e)适用于哺乳动物细胞生长的无血清低葡萄糖培养基，其中所述无血清低葡萄糖培养基构成所述细胞生长培养基的总体积的75％至97％，且可以包含部分(d)的L-谷氨酰胺；

其中所述细胞生长培养基允许人类CD34^-干细胞的扩增，所得经扩增的CD34^-干细胞保持分化的能力。

本发明还提供了一种细胞生长培养基补充物，其包含：

(a)无直径大于0.22μm的固体物质的人类血小板裂解物，其中所述裂解物构成所述细胞生长培养基补充物的总体积的17％至94％；和

(b)无直径大于0.22μm的固体物质的人类新鲜冰冻血浆(FFP)滤出物，其中所述FFP滤出物构成所述细胞生长培养基补充物的总体积的6％至83％；

其中在将所述细胞生长培养基补充物与肝素和含L-谷氨酰胺的、适用于哺乳动物细胞生长的无血清低葡萄糖培养基组合，从而构成细胞生长培养基时，所得到的细胞生长培养基允许人类CD34^-干细胞的扩增，且所得经扩增的CD34^-干细胞保持分化的能力，所述细胞生长培养基包含(i)3体积％至25体积％的细胞生长培养基补充物；(ii)浓度为0U/ml至10U/ml的肝素；和(iii)浓度为0.5mM至10mM的L-谷氨酰胺。

本发明另外提供了一种无直径大于0.22μm的固体物质的人类血小板裂解物，其中根据下列步骤制备所述血小板裂解物：

(i)冷冻血小板浓缩物，从而使其中的血小板裂解；

(ii)融化得到的经裂解的血小板；