[发明专利]用于识别具有结合配体能力的异源多聚体修饰的泛素蛋白质的方法

说明书

技术领域

本发明涉及识别具有结合配体能力的异源多聚体泛素的方法。此外，本发明提供编码所述异源多聚体泛素蛋白群的DNA库和由所述DNA库的表达获得的蛋白质库、包含所述DNA或蛋白质的细胞和噬菌体、编码所述融合蛋白的多聚核苷酸和包括所述多聚核苷酸的载体。进一步提供能够以高亲和力特异性地结合到所选择的配体上的以异源多聚体泛素为基础的新的结合蛋白质（binding protein）。

背景技术

对于由氨基酸组成的，但不是免疫球蛋白的结合分子的需求日益增加。迄今为止，虽然抗体代表确定的最好的结合分子，但是因为免疫球蛋白分子具有较大的缺陷，为了以高亲和力和高特异性靶向配体，仍然需要新的结合分子。尽管它们能很容易地制造且它们可指向几乎任何一个靶，它们仍然具有相当复杂的分子结构。仍然需要能够易于操作的更小的分子取代抗体。这些可替换的结合剂能有利地用于，例如诊断、预防和疾病的治疗的医疗领域。

蛋白具有相对确定的通常被称为蛋白质骨架的三维结构，且可作为用于设计所述可替换的结合剂的起始材料。这些骨架通常包含一个或多个区域，这些区域受特异的或随机的序列变化作用，且经常发生这种序列随机化，以制造蛋白质文库，从蛋白质文库中可选出特异的结合分子。预期具有比抗体更小的尺寸，且对靶抗原具有相当、甚者更好的亲和力的分子在药物动力学性能和免疫原性方面超过抗体。

先前的许多方法确实使用蛋白质骨架作为结合蛋白的起始材料。例如，在WO 99/16873中，开发对某种配体表现出结合活性的脂质运载蛋白（lipocalin）家族（所谓的Anticalin（一种抗体类似物））的修饰蛋白。利用遗传工程的方法，通过在其天然配体结合口袋（pocket）进行氨基酸置换，对脂质运载蛋白家族肽的结构进行修饰。类似免疫球蛋白，Anticalin可用于确定或结合分子结构。在某种意义上类似于抗体，柔性环形结构被修饰；这些修饰能够确定与天然配体不同的配体。

WO 01/04144描述在蛋白本身缺少结合位置β片结构中的蛋白表面上人工产生的结合域。通过这种方法重新产生人工的结合域，例如能够获得γ-晶状体球蛋白-一种眼睛晶体结构蛋白-的变体，其对配体具有高亲和力和特异性。和已经出现且由上述提及的拟抗体的柔性环形结构形成的结合位置的修饰相比，这些结合域重新在β片的表面上产生。然而，WO01/04144只描述用于产生新的结合性能的相对大的蛋白的变化。由于它们的尺寸，根据WO 01/04144蛋白仅能在遗传工程水平上通过需要某些努力的方法来修饰。此外，为了维持蛋白的整体结构，迄今为止公开的蛋白中只有总氨基酸相对小的百分数部分被修饰。因此，只有相对小的蛋白表面的区域是可用的，其能用于产生以前不存在的结合性能。而且，WO01/04144只公开对γ-晶状体球蛋白产生的结合性能。

WO 04/106368描述以泛素蛋白为基础的人工结合蛋白的产生。泛素是小的、单体的、和细胞溶质的蛋白，其序列高度保守且出现在所有已知的从原生动物到脊椎动物的真核细胞中。其在生物体的细胞蛋白的可控降解的调节中充当至关紧要的角色。为了这种目的，用于降解的蛋白在它们通往酶的级联反应期间共价地连接到泛素或多聚泛素链上，且由于这种标签选择性地降解蛋白。根据最近的结果，泛素或泛素的蛋白标签，也分别在其他细胞程序中充当重要的角色，例如几种蛋白的输入或其基因调节。

除了它的生理机能的阐明之外，由于它的结构和蛋白化学性质，泛素是主要的研究目标。泛素的多肽链由76个在非常紧密的α/β结构（Vijay-Kumar,1987）中折叠的氨基酸组成：几乎87%的多肽链涉及通过氢键的二级结构元件的形成。主要的二级结构是三个和半个α螺旋转角和由四股组成的反平行β片。这些元件的特征排列通常被认为是所谓的类泛素折叠基序（ubiquitin-like folding motif）-反平行β片暴露在后侧上的蛋白表面，其中α螺旋垂直地堆积在顶上。进一步的结构特征是蛋白内部α螺旋和β片之间标记的疏水区域。

因为它的小的尺寸，能通过化学合成和依靠生物科技的方法两种途径进行泛素的人工制备。由于有利的折叠性能，能通过遗传工程利用微生物例如埃希氏大肠杆菌（Escherichia coli）以相对大的数量在细胞溶质或在外周胞质空间制造泛素。因为外周胞质中占优势的氧化条件，后面的方法通常专供分泌蛋白的制造之用。由于简易和有效的细菌制备，泛素能用作其他外源蛋白的融合伴侣，以制备难于生产的产品。依靠融合，能获得溶解性改善的泛素并因此获得提高的产量。