[发明专利]用于识别具有结合配体能力的异源多聚体修饰的泛素蛋白质的方法

权利要求书

1.一种用于识别具有结合配体能力的异源多聚体修饰的泛素的方法，包括下列步骤：

a）提供来源于单体修饰的泛素蛋白质的异源多聚体修饰的泛素的群，所述群包括异源多聚体蛋白质，所述异源多聚体蛋白质包括两个或更多以首尾排列的方式连接在一起的泛素单体，其中所述异源多聚体蛋白质的至少一个所述单体是至少通过定位在SEQ ID NO:1的位置2、4、6、8、62、63、64、65、66和68处的至少三个氨基酸中的表面暴露的氨基酸的取代而不同地修饰的，所述修饰的单体蛋白质与未修饰的泛素蛋白质具有至少80％或至少90％或至少95％的氨基酸序列同一性；

b）为所述不同地修饰的泛素蛋白质的群提供潜在的配体；

c）使所述不同地修饰的蛋白质的群与所述配体接触；

d）通过筛选方法识别异源多聚体修饰的蛋白质，其中所述修饰的异源多聚体蛋白质以Kd范围是10^-7-10^-12M的特定的结合亲和力结合于所述配体并且对于所述配体表现单价的结合活性；和可选地

e）利用所述结合亲和力分离所述异源多聚体修饰的泛素。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述异源多聚体蛋白质是异源二聚体或异源三聚体蛋白质。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述修饰的单体蛋白质包括总共1至10个氨基酸中一个或更多的插入和/或总共1至7个氨基酸中一个或更多的缺失，进一步可选地其中所述修饰的单体泛素蛋白包括至少6个和最多14个氨基酸的取代，并且其中所述修饰的异源二聚体的泛素蛋白包括总共至少12个和最多28个取代，和/或包括总共至少1个和最多20个插入和/或至少1个和最多14个缺失。

4.根据前述权利要求中的任一项所述的方法，其中所述修饰的单体泛素蛋白是通过编码泛素的DNA的遗传工程，并且在原核或真核生物体内或体外表达所述蛋白而获得的。

5.根据前述权利要求中的任一项所述的方法，其中通过体外选择方法提供所述多聚体蛋白质，所述体外选择方法优选地是展示方法，可选地为噬菌体展示、核糖体展示、TAT噬菌体展示、酵母菌展示、细菌展示、细胞表面展示或mRNA展示方法。

6.根据前述权利要求中的任一项所述的方法，其中所述配体是抗原或半抗原。

7.根据前述权利要求中的任一项所述的方法，其中进一步地在至少一个所述单体泛素蛋白中的1至7个另外的氨基酸被取代，其可选地选自在位置36、44、70、71的一个或更多的氨基酸，和可选地附加地SEQ ID NO:1的位置62、63和64或72和73或8的氨基酸。

8.根据前述权利要求中的任一项所述的方法，其中所述泛素的异源多聚体融合蛋白的群通过以下方式提供：遗传上融合两个DNA库，所述DNA库每一个编码不同地修饰的单体蛋白质，将所述DNA翻译成异源多聚体融合蛋白质，展示所述蛋白质并在修饰的异源多聚体泛素蛋白存在下筛选展示的蛋白质，所述修饰的异源多聚体泛素蛋白包括以首尾排列连接在一起的单体泛素蛋白，其中所述修饰的异源多聚体泛素蛋白以Kd范围是10^-7-10^-12M的特定的结合亲和力结合所述配体并且对于所述配体表现出单价的结合活性，或者其中通过蛋白质的化学合成提供所述泛素的异源多聚体的融合蛋白质的群。

9.一种DNA库，包含编码来源于单体泛素的异源多聚体泛素融合蛋白的群的DNA，每一个多聚体蛋白质包括两个或更多以首尾排列的方式连接在一起的修饰的泛素单体，其中每个所述多聚体蛋白质的所述单体的至少两个被不同地修饰，这种修饰至少通过在位于SEQ ID NO:1的位置2、4、、6、8、62、63、64、65、66和68处的至少三个氨基酸中的表面暴露的氨基酸的取代而实现，所述修饰的单体蛋白质与未修饰的蛋白质具有的氨基酸序列同一性为至少80％或至少90％或至少95％。

10.一种通过权利要求9所述的DNA库的表达获得的蛋白质库。

11.一种包含根据权利要求9或10所述的DNA或蛋白质库的原核的或真核的细胞或噬菌体的群。

12.一种多聚核苷酸，编码权利要求10所述的蛋白质库的融合蛋白质。

13.一种载体，包括根据权利要求12的多聚核苷酸。