[发明专利]未甲基化核酸的选择性积累

说明书

技术领域

本发明属于生物学和化学领域，更具体来说属于分子生物学领域。具体来说，本发明涉及核酸的未甲基化区域的扩增和核酸中甲基化模式的分析。

发明背景

甲基化是DNA的常见化学修饰，其中甲基被转移到核苷酸碱基上，例如胞嘧啶的嘧啶环的5位碳处。这一般通过特定的DNA甲基转移酶从头形成或在例如DNA复制期间维持已有的甲基化模式而发生。

DNA甲基化可以具有多种功能：例如，它可以被原核生物用来将内源DNA与导入到原核生物中的外来DNA区别开。此外，除了其他功能之外，它还在原核生物DNA合成期间的错误校正中发挥重要作用，使得原始（模板）链与新合成的链区分开。许多原核生物具有在特定信号序列处或附近对内源DNA进行甲基化的DNA甲基转移酶。在这些生物体中，外来的未甲基化DNA可以被特异性甲基化敏感性限制性内切核酸酶在信号序列处或附近切开，并由此降解。

除了上面提到的只切开未甲基化区域的甲基化敏感性内切核酸酶之外，还存在甲基化依赖性内切核苷酸，其只在特定甲基化序列处或紧挨所述序列切开。

在真核生物中，DNA的甲基化提供了另一层信息，例如允许将基因组的活性区域与无活性区域区分开。甲基化模式在特别是差异基因表达中具有特殊作用，并因此也与肿瘤发生相关。

本技术领域的专业人员已知有多种来自于现有技术的方法可用于获得关于DNA中的甲基化模式的信息：例如在亚硫酸盐测序中，首先将待分析的DNA与亚硫酸盐反应以使未甲基化的胞嘧啶转变成尿嘧啶，然后利用PCR进行扩增并进行DNA测序。从亚硫酸盐处理和未亚硫酸盐处理的DNA之间的序列差异，可以推断出隐含的甲基化模式。或者，也可以使用甲基化特异性引物、即与未转变的序列互补的引物，利用甲基化特异性PCR（MSP）来分析亚硫酸盐处理过的DNA。作为亚硫酸盐技术的替代方案，可以使用其他方法例如甲基化特异性限制性分析或甲基化DNA免疫沉淀（MeDIP）。

这些方法的目标是限定序列区域的甲基化分析和限定序列区域的甲基化程度定量。

发明描述

本发明提供了可用于确立DNA的整体甲基化模式的方法。因此，本发明的方法的目标主要是鉴定含有甲基化区域的基因组区段。在特别优选的实施方案中，本发明的目标是鉴定含有甲基化区域的基因组区段，而不是测定具体各个碱基的甲基化状态。

使用本发明的方法，也可能执行未甲基化DNA的选择性制备。

方法由几个子步骤组成：

（1）将DNA、优选为基因组DNA用甲基化依赖性核酸酶消化。

（2）在消化后，利用扩增方法、优选为随机引发的序列扩增方法来复制DNA，因此只有未甲基化的DNA区段、即没有被切开的那些区段，可以被复制。扩增的结果是复制的DNA不含较早时被甲基化依赖性核酸酶切开的那些区段。因此，该方法引起未被甲基化的序列部分的选择性积累和复制。

（3）任选地，随后可以对按照方法选择和扩增的DNA中的序列区段的拷贝数执行定量分析。

后者可用于分析DNA或其子区段的甲基化模式，即DNA或其限定部分最初被甲基化的程度。

因此，本发明的方法与用于分析核酸甲基化的其他方法互补。

本发明的方法可以帮助鉴定被甲基化的基因组区段。通过扩增所选序列，该方法允许在不必了解准确甲基化位点的情况下进行整体甲基化分析。

因此，本发明提供了用于对DNA的未甲基化序列进行选择性扩增的方法，所述方法包含下列步骤：

（i）提供包含在至少一个位点处被甲基化的DNA的样品，

（ii）用甲基化依赖性核酸酶处理样品中的DNA，以及

（iii）使用甲基化依赖性核酸酶对切开的DNA进行扩增。

步骤（ii）和（iii）可以同时或相继执行。