[发明专利]用于诊断针对病毒的免疫应答的方法

说明书

发明领域

本发明涉及医药领域。本发明尤其涉及病毒学和免疫学领域，更具体地本发明涉及用于诊断针对病毒的细胞免疫应答的方法，其使用灭活的病毒，如流感病毒。

发明背景

对高致病性和流行性流感病毒进行研究需要BSL-3的高度密封设施。这种设施的限制实质上影响了实验室潜力。因此，存在对能够检测针对高致病性流感病毒的免疫应答的测定的需要，其可以在不需要BSL-3高度密封设施的情况下进行。

通过将高致病性和流行性流感病毒灭活，可以在不具有BSL-3分级的实验室中使用这些病毒。目前，在生产裂解和亚单位流感疫苗的过程中，福尔马林化学处理应用于灭活流感病毒，并且还可用于全流感病毒灭活(1，2)。福尔马林通过不可逆地交联蛋白质起作用，从而彻底去除病毒感染性(3)。因此，此过程有效地灭活了流感病毒并且允许在BSL-3限制之外使用福尔马林处理的灭活病毒。

通过标准血细胞凝集和神经氨酸酶抑制试验确定针对流感的体液免疫应答(4，5，12)。然而，已经显示难以检测针对灭活流感病毒的细胞免疫应答。通过常规的⁵¹Cr释放测定确定CTL活性缺乏灵敏度(6)。在⁵¹Cr释放测定之前，7天体外刺激期间的记忆CTL扩增很可能遮掩任何差异，表明体外扩增会降低该测定的灵敏度。更灵敏的测定如ELISPOT测定能够检测由邻近细胞产生的分泌细胞因子，并且不需要体外扩增步骤(7)。尽管ELISPOT是灵敏的，此测定并不能同时检测多重效应子功能并且不能区分不同的功能性群体。

重要的是，已经显示具有多重效应子功能(即产生多种细胞因子和/或细胞毒性物质)的T细胞(多功能T细胞)对确定免疫应答质量是重要的。因此，通过流式细胞仪检测这些细胞有助于确定疫苗质量和疫苗设计(8)。

Rutebemberwa等人(9)公开了用二硫二吡啶(Aldrithiol)灭活HIV-1的方法。然后分离PBMC并将其暴露于灭活的病毒，进行流式细胞测定以检测尤其是IFN-γ。

Skarsvik等人(10)公开了如何用热灭活的柯萨奇(Coxsackie)病毒刺激PBMC，其随后用若干标记物通过流式细胞测定检测T细胞活化。

Betts等人(11)公开了用代表HIV-1的抗原部分的混合肽刺激PBMC，其随后用若干标记物通过流式细胞分析检测T细胞活化。然而，对确定针对整个活病毒的完整的生理学相关CD8 T细胞应答来说，使用重叠肽不是有效的选择。产生覆盖完整病毒蛋白组的重叠肽库并同时拥有足够的待用这些库刺激的PBMC实际上是不可能的。另外，外源添加的肽缺少了在MHC分子呈递前对肽的胞内处理，从而可能错过依赖于胞内翻译后修饰的应答。此外，天然处理允许在天然水平将肽呈递，其导致生理学相关的体外免疫应答，而外源添加的肽可能导致刺激生理学无关的T细胞应答。

然而，现有技术没有公开使用灭活病毒检测针对病毒的T细胞应答的方法，其中T细胞应答可靠地反映足够强度的由活病毒获得的应答。现有技术尤其没有公开这样的用于检测针对流感病毒的T细胞应答的方法。

因此，本领域仍存在着对提供用于可靠地并同时灵敏地检测多种标记物并用于确定针对病毒特别是流感病毒的T细胞应答的表型(phenotyping)(在效应子功能的数量和类型以及不同标记物的表达方面)的手段和方法的需要。本发明的目的是提供这样的手段和方法。

发明概述

检测针对病毒的免疫应答中的一个复杂因素是活病毒的使用通常被视为对确定CD8⁺T细胞应答是绝对必须的，因为只有活病毒感染的T细胞允许在I型MHC分子上通过直接呈递途径表达病毒表位(K.L.Rock，The Journal of Immunology，2010，184，9-15)。然而，因为活病毒感染需要用于高致病性病毒的BSL-3条件，我们已经开发了允许检测用灭活病毒刺激后的CD8 T细胞应答的方法。本技术利用了替代的呈递路线，其为树突状细胞和巨噬细胞独有的，通过称作交叉呈递的过程将其外部环境中的抗原呈递在I型MHC肽上(K.L.Rock，The Journal of Immunology，2010，184，9-15)。

在第一方面，本发明涉及用于检测对象中针对病毒的免疫应答存在的方法。所述方法优选为用于检测针对病毒的细胞免疫应答的方法。更具体地，该方法检测针对病毒的T细胞应答。用于检测对象中针对病毒的免疫应答的方法优选包括步骤：a)将来自所述对象的PBMC与灭活的病毒孵育；和，b)通过流式细胞术检测所述PBMC中至少一种T细胞活性标记物的表达。