[发明专利]制备间充质干细胞、组合物和其试剂盒的方法

说明书

技术领域

本发明涉及干细胞处理过程及在干细胞基础上得到组合物以用于临床应用的方法。特别地，涉及一种处理抽取的骨髓以分离间充质干细胞（MSC）及其大规模培养/扩增以进一步用于临床应用的方法。

背景技术

在人骨髓中间充质干细胞（hMSC）数量极少，仅占有核细胞的0.001至0.01%，但是他们在培养基中能很快地生长和扩增，而不失去干细胞特性。hMSC由于具有以下特性而具有提高修复受损组织的潜能：（1）易分离；（2）高扩增潜力；（3）遗传稳定性；（4）从分离到分离的可再生（可再现）属性；（5）可再生特性；（6）与组织工程方法的兼容性。

目前MSC和类MSC细胞还能从除骨髓之外的多种其他组织中分离出来，这些组织包括脂肪组织、羊水、骨膜和胎儿组织，并表现出表型差异。表型上，MSC表达多个标志物，然而，不巧的是，没有一个是MSC特异的。

从人骨髓获得的间充质干细胞（hBMSC）已被广泛研究，是由于其相对易获得且具有分化为骨原细胞、成脂细胞、软骨细胞和包括肝细胞、心肌细胞和神经元的其他种类组织或细胞的潜能。其多潜能性及自我更新性使其作为自我更新细胞来源及在可再生药物的应用方面得到了更多的关注。另外，其基于对培养物的粘附性的基础上的分离形成了去除非间充质系细胞系的简单方法、降低了对基于特征表面标记物表达的复杂细胞分离方法的依赖性。

源于骨髓的MSC的局限性是其数量少，而临床应用需要应用大量的MSC。本发明提供了处理源于骨髓的MSC和为临床应用进一步大量扩增的方法。

发明内容

本发明公开了一种制备包含间充质干细胞、胎牛血清（FBS）和二甲基亚砜（DMSO）的主细胞库（原始细胞库，Master Cell Bank）组合物的方法，所述的方法包含以下步骤：a）获得骨髓细胞并在培养基中将其稀释，离心经稀释的细胞以得到第一团块（the first pellet），并用培养基将第一团块重新稀释，b）向重新稀释后的团块中加入密度梯度溶液并离心以在界面处得到阻挡层（buffy layer），c）向阻挡层中加入等体积的培养基并离心以获得第二团块（a second pellet），然后将第二团块悬浮于培养基中，并孵育以获得约80%至85%的汇合率（汇合度），d）吸出培养基并用杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS）清洗汇合细胞，然后用0.25%的胰酶处理细胞并再次孵育经处理的细胞，e）用中和培养基将经再次孵育的细胞中和并再次将细胞离心以获得第三团块（a third pellet），然后使第三团块悬浮在培养基中，并用包含约85%至95%的FBS和约5%至15%的DMSO的冷冻培养基将细胞冷冻，以及f）将冷冻的细胞用胰酶处理，并使经胰酶处理的细胞再次悬浮于冷冻培养基中以获得主细胞库组合物；一种制备包括间充质干细胞、胎牛血清（FBS）和二甲基亚砜（DMSO）的工作细胞库（Work Cell Bank）组合物的方法，所述方法包含以下步骤：a）如上所述，用来自于不同捐献者的骨髓细胞制备主细胞库组合物，b）从组合物中获得细胞团块，然后使细胞团块悬浮于培养基并等比例汇合细胞以得到细胞集合（cell aggregate），c）用培养基培养所述细胞集合，然后孵育已得到约80%至85%的汇合率并再次执行以上步骤（d），d）用培养基中和再次孵育的细胞，然后将细胞离心以获得第二团块，并使第二团块悬浮在培养基中以获得培养细胞，e）再次将培养细胞离心并用包含约85%至95%的FBS和约5%至15%的DMSO的冷冻培养基将细胞冷冻，以获得工作细胞库组合物；一种制备包括间充质干细胞、勃脉力A液（plasmalyte A）、人血清白蛋白（HSA）、二甲基亚砜（DMSO）的组合物的方法，所述组合物选择性具有药用添加剂，所述方法包括以下步骤：a）如上述制备工作细胞库组合物，b）从组合物中获得间充质干细胞，用培养基培养细胞并孵育以得到约80%至85%的汇合率，再次执行上述步骤（d），c）用培养基中和经再次孵育的细胞，然后将细胞离心以获得细胞团块，在DPBS中清洗细胞团块，然后再次离心以获得第二细胞团块，d）使第二细胞团块悬浮于完全培养基中并培养细胞，然后将培养后的细胞孵育，并向经孵育的细胞中加入完全培养基以获得约80%至85%的汇合率，e）用胰酶消化汇合细胞并用DPBS再次清洗细胞，然后用0.25%的胰酶处理经再次清洗的细胞，并孵育经处理的细胞，接着用完全培养基中和孵育后的细胞，f）离心经中和的细胞并用DPBS清洗经离心的细胞，再次离心以获得第三团块，g）用勃脉力A液、DMSO和人血清白蛋白冷冻第三团块并选择性地包含药用添加剂以获得组合物；包括间充质干细胞、人血清白蛋白（HSA）、勃脉力A液和二甲基亚砜（DMSO），并可选性地具有任意药用添加剂的组合物；一种包括间充质干细胞、胎牛血清（FBS）和二甲基亚砜（DMSO）的主细胞库或工作细胞库组合物；包含上述组合物和说明书的试剂盒。