[发明专利]制备间充质干细胞、组合物和其试剂盒的方法

权利要求书

1.一种制备包括间充质干细胞、胎牛血清（FBS）和二甲基亚砜（DMSO）的主细胞库组合物的方法，所述方法包括以下步骤：

a.获取骨髓细胞并在培养基中稀释骨髓细胞，将经稀释的细胞离心以获得第一团块，并用所述培养基再次稀释所述第一团块；

b.向再次稀释的团块中加入浓度梯度溶液并离心以在界面处获得阻挡层；

c.向所述阻挡层中再次加入等体积的所述培养基并离心以获得第二团块，然后使所述第二团块悬浮于所述培养基中并孵育以达到约80%至85%的汇合率；

d.将所述培养基吸出并用杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS）清洗汇合细胞，然后用0.25%的胰酶处理细胞并再次孵育经处理的细胞；

e.用中和培养基中和经再次孵育的细胞并再次离心所述细胞以获得第三团块，然后将所述第三团块悬浮于培养基中，并用包含约85%至95%的FBS和约5%至15%的DMSO的冷冻培养基将所述细胞冷冻；以及

f.将经冷冻的所述细胞用胰酶消化并将经胰酶消化的细胞再次悬浮于所述冷冻培养基中以获得主细胞库组合物。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述孵育是在温度为约37°C的5%CO₂的孵育箱中进行的；通过在约7天至8天后补充所述培养基达到所述汇合率；所述中和培养基包括达尔伯克氏改良伊格尔培养基-KnockOut[DMEM-KO]、约10%的胎牛血清[FBS]和约0.5%的青霉素-链霉素；所述再次孵育过程是在37°C的孵育箱中进行约2分钟至3分钟。

3.一种制备包含间充质干细胞、胎牛血清（FBS）和二甲基亚砜（DMSO）的工作细胞库组合物的方法，所述方法包括以下步骤：

a.根据权利要求1由获自不同捐献者的骨髓细胞制备主细胞库组合物；

b.从所述组合物中获得细胞团块，然后将所述细胞团块悬浮于培养基中，并按相同的比例将所述细胞汇集以得到细胞集合；

c.用所述培养基培养所述细胞集合，然后孵育以达到约80%至85%的汇合率并再次执行权利要求1的步骤（d）；

d.用所述培养基中和经再次孵育的细胞，然后离心所述细胞以获得第二团块，并将所述第二团块悬浮于所述培养基中以获得经培养的细胞；以及

e.将经培养的细胞再次离心并用包含约85%至95%的FBS和约5%至15%的DMSO的冷冻培养基冷冻所述细胞团块以获得所述工作细胞库组合物。

4.根据权利要求3所述的方法，其中所述主细胞库组合物包括范围在约1百万细胞至3百万细胞的间充质干细胞、范围在约85%至95%的胎牛血清（FBS）和范围在约5%至15%的二甲基亚砜（DMSO）。

5.根据权利要求3所述的方法，其中所述细胞团块的获得是通过解冻干细胞、用完全培养基中和冷冻培养基并以约1200rpm至1500rpm持续离心约10至20分钟以获得细胞团块。

6.一种制备包含间充质干细胞、勃脉力A液、人血清白蛋白（HSA）、二甲基亚砜（DMSO）的组合物的方法，所述组合物可选地包含药用添加剂，所述方法包括以下步骤：

a.根据权利要求3制备工作细胞库组合物；

b.从所述组合物中获得间充质干细胞，然后用培养基培养所述细胞并孵育以达到约80%至85%的汇合率，并再次执行权利要求1的步骤（d）；

c.用所述培养基中和经再次孵育的细胞，然后离心所述细胞以获得细胞团块；用DPBS清洗所述细胞团块然后再次离心以获得第二细胞团块；

d.在所述完全培养基中重悬所述第二细胞团块并培养所述细胞，接着孵育所述培养细胞并向经孵育的细胞添加所述完全培养基以达到约80%至85%的汇合率；

e.将汇合的所述细胞用胰酶消化并用DPBS再次清洗；然后用0.25%的胰酶处理经再次清洗的细胞并孵育经处理的细胞，然后用所述完全培养基中和经孵育的细胞；

f.将经中和的细胞离心并用DPBS清洗经离心的细胞，然后再次离心以获得第三团块；以及

g.用勃脉力A液、DMSO和人血清白蛋白冷冻所述第三团块，可选地添加药用添加剂以获得所述组合物。

7.根据权利要求6所述的方法，其中所述工作细胞库组合物具有范围在约1百万至3百万的间充质干细胞、范围在约85%至95%的胎牛血清（FBS）和范围在约5%至15%的二甲基亚砜（DMSO）。