[发明专利]具有提高的生产丁醇能力的重组微生物和使用其生产丁醇的方法

说明书

技术领域

本发明涉及具有提高的生产丁醇能力的重组微生物，和使用其生产丁醇的方法。更具体来说，本发明涉及生产丁醇的能力通过操纵它们的代谢网络而提高的重组微生物和使用其生产丁醇的方法。

背景技术

近来油价上升引发了对替代燃料如生物燃料的越来越多的兴趣。而且，对具有比乙醇更优异的物理性质的汽油替代品-丁醇有越来越多的兴趣，因此对生产溶剂如丁醇作为代谢产物的梭菌种(Clostridium sp.)菌株也有越来越多的兴趣。

已知梭菌种的微生物是革兰氏阳性、严格厌氧的形成芽孢的细菌，并且主要产生乙酸和丁酸作为发酵产物。其中，一些菌株引发丙酮-丁醇-乙醇发酵(下文称作ABE发酵)，该发酵除上述有机酸外还产生丙酮、丁醇和乙醇。

实际上，在20世纪早期，作为这样的菌株之一的丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)被用于大量地生产丙酮和丁醇。这种大规模生产持续到1960年代和1970年代，但除了在一些国家外，这种生产都中断了，因为由原油产生的丙酮和丁醇由于化学工艺的发展而变得廉价，以及难以供应底物。

至今仍利用梭菌种菌株进行的生物丁醇生产产生以下问题。首先，与基于酵母的生物乙醇生产相比，其表现出显著低的收率和生产效率。其次，梭菌种菌株除产生作为生物燃料的非常有价值的丁醇外，还产生副产物，包括丙酮、乙酸和丁酸，这提高了它们的分离成本。

在产生溶剂的梭菌种菌株中，如同一般的微生物发酵，有机酸的产生在指数生长期发生。这个阶段被称为产酸阶段。随着静止期到来，细胞代谢转变为产溶剂阶段，在此阶段有机酸被再吸收并且产生溶剂如丙酮(或异丙醇)、丁醇和乙醇。这可以解释如下。随着静止期到来，pH值降低，因此未解离有机酸的浓度增加。在这些酸中，未解离的丁酸表现出高细胞毒性。通过有机酸的这一再吸收以及转化为溶剂，细胞获得时间而形成可以在严酷环境下长期存活的芽孢。

在野生型菌株中，发酵后以约为3:6:1的质量比产生丙酮、丁醇和乙醇，并且还产生痕量的乙酸、丁酸和乙偶姻。已知葡萄糖用作底物时，在最终浓度约10g/L时以约为20-25%的质量收率生产丁醇(Lee等人，Biotechnol.Bioeng.，101(2):209-228，2008)。当采用这种野生型菌株生产丁醇时，存在产量及产率低以及难于从其它代谢产物中分离出丁醇的问题，因此增加了生产成本。

为此，近年来，致力于基于基因工程知识和工具，利用按需操纵代谢路径的代谢工程途径来制作改进的菌株。对于丙醇丁醇梭菌，其产生代谢产物的路径已长期为人所知，并且其基因组已被测序，且其相应的基因被全部鉴定(Nolling等人，J.Bacteriol.2001)。

丁醇生产中问题最大的代谢物是丙酮。如果使用气提进行溶剂分离，那么丙酮和丁醇作为混合物被分离，因为不像有机酸，它们都容易蒸发，因此需要额外的分离过程。乙酰乙酰-CoA通过CoA移转酶和乙酰乙酸脱羧酶转化成丙酮。这些酶分别由基因ctfAB和adc表达。所以，通过删除一种或多种这些基因，丙酮在溶剂中的浓度可以被降低。根据最近的报道，发现删除adc可以降低丙酮浓度，确实可以降低丙酮比例(Jiang等人，Metab.Eng.，11(4-5):284-291，2009)。

而且，在梭菌种的情况下，有这样的例子，其中通过单交换插入质粒删除表达磷酸转乙酰酶的基因pta(磷酸转乙酰酶为乙酸生产路径的酶)和表达丁酸激酶的基因buk(Green等人，Microbiology.142:2079-2086，1996)。但是，有报道，当删除编码丁酸激酶的基因buk时，丁醇浓度增加至约16g/l，但是当删除编码磷酸转乙酰酶的pta基因时，丁醇的浓度为9.9g/l，表明丁醇的浓度和丁醇的选择性没有实质的增长。

WO2008/052973公开了其中丁酸生产路径和乙酸生产路径被阻断的菌株，以及其中丁酸生产路径、丙酮生产路径和乙酸生产路径被阻断的菌株。但是，必须阻断丁酸生产路径，因此，当仅删除乙酸生产路径时，无法确定产生丁醇的能力是否增加。另外，WO2008/052973公开了基于buk或ptb的删除的各种基因组合的删除，但其实例示出的仅为通过删除buk基因获得的已知的结果，并且该专利文件公开了涉及删除各种基因组合的实例。换言之，该专利文件总体上仅提出了基于buk或ptb删除的可能的各种基因组合的删除，并没有提供科学实验基础，但这不可能确定这些删除能否有助于实际丁醇生产中浓度、收率、选择性等的提高。