[发明专利]用于核酸分子检测的方法、试剂和试剂盒

说明书

序列表

计算机可读形式的序列表全部以引用的方式并入本文。

发明背景

近来，已鉴定出一类称为微小RNA(miRNA)的小型非编码RNA，其在植物和动物的基因表达的转录后调控中起作用(Carrington和Ambrose,Science 301:336(2003))。最初在线虫(C.elegans)中被鉴定的miRNA通过与其靶mRNA的3'未翻译区域(UTR)或编码序列中的互补位点进行碱基配对并且抑制它们的翻译而发挥作用(Wang等,Nucleic.Acids Res.32:1688(2004))。

尽管成熟miRNA长度仅为约22个核苷酸(nt)，但是其通过Dicer复合体的作用而来源于约70聚体的前体(前体miRNA)序列的发夹区域(Lee等,EMBO J.21:4663(2002))。所述成熟miRNA随后被并入miRNP，其为介导miRNA对基因调控的效果的核糖核蛋白复合体(Mourelatos等,Genes Dev.16:720(2002))。

生物信息学研究预测在蠕虫和果蝇基因组中编码了约100种miRNA，并且脊椎动物基因组中编码了约250种miRNA(Lai等,Genome Biol.4:R42(2003)；Lim等,Genes Dev.17:991(2003)；Lim等,Science 299:1540(2003))。这占到各基因组的经过预测的蛋白质编码基因数量的约0.5-1%，显示了miRNA作为一类调控性基因产物的重要性(Brennecke和Cohen,Genome Biol.4:228(2003))。

miRNA牵涉到多种生物过程，包括植物中的花与叶的发育，蠕虫中的幼虫发育，果蝇中的凋亡和脂肪代谢，以及哺乳动物中的造血分化和神经元发育(Bartel,Cell 116:281(2004))。此外，多种miRNA基因位于与癌症关联的人染色体区域(如，脆性位点、断点、杂合性缺失区域、扩增区域)(Calin等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA101:2999(2004))。多种miRNA还被显示在体内与脆性X智力低下蛋白(FMRP)相互作用(Jin等,Nat.Neurosci.7:113(2004))，这暗示了这些小RNA在人类健康和疾病中的作用。

由于不同的细胞类型和疾病状态与特定miRNA的表达有关联，因此获得miRNA的时间和空间表达特征是很重要的。Northern杂交已被用于测定miRNA的表达水平(参见，例如Sempere等,Genome Biol.5:R13(2004)；Aravin等,Dev.Cell 5:337(2003)；Grad等,Mol.Cell 11:1253(2003)；Lim等,Genes & Dev.17:991(2003))，但是这种方法对于高通量分析而言工作过于繁重。基于PCR的方法已被用于监测miRNA的表达，但是这些方法需要使用高成本基因特异性引物(参见，例如Schmittgen等,Nucleic Acids Res.32:e43(2004))或需要进行低效率的平端连接以将引物结合连接物结合于所述miRNA分子(参见，例如Miska等,Genome Biol.5:R68(2004)；Grad等,Mol.Cell11:1253(2003)；Lim等,Genes & Dev.17:991(2003))。此外，PCR可向所扩增的靶miRNA分子群体中引入显著的偏倚性。

高通量的微阵列最近已被开发用于在多种组织和细胞类型中鉴定miRNA的表达模式(参见，例如Babak等,RNA 10:1813(2004)；Calin等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 101:11755(2004)；Liu等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 101:9740(2004)；Miska等,Genome Biol.5:R68(2004)；Sioud和BioTechniques 37:574(2004)；Krichevsky等,RNA 9:1274(2003))。微阵列的使用对于miRNA表达的检测具有多种优点，包括在单一时间点在同一样品内检测多种基因表达的能力、仅对少量RNA的需求以及对前体和成熟miRNA分子的表达进行同时鉴定的潜力。