[发明专利]用于核酸分子检测的方法、试剂和试剂盒

权利要求书

1.一种核酸标记分子，其上连接有一个或多个能够发射或产生可检测信号的标记分子，其中所述核酸标记分子包含含有能够与核酸序列杂交的5’磷酸基团的寡核苷酸延伸序列。

2.根据权利要求1所述的核酸标记分子，其具有约5kDa至约250kDa的分子量。

3.根据权利要求1所述的核酸标记分子，其包含1至约15个标记分子。

4.根据权利要求1所述的核酸标记分子，其中所述标记分子由生物素或荧光团组成。

5.根据权利要求1所述的核酸标记分子，其呈具有高至约5kDa的分子量并且在其3'末端具有单一生物素分子的单链DNA寡核苷酸的形式。

6.一种用于产生经过标记的靶RNA分子的方法，其包括：

a)提供具有5'和3'末端的单链RNA分子；

b)将寡核苷酸尾连接于所述单链RNA分子的3'末端；

c)提供具有正义链和反义链的部分双链核酸序列，其中所述正义链包含核酸标记分子，所述核酸标记分子在其3'末端包含一个或多个能够发射或产生可检测信号的标记分子，并且所述反义链包含单链3'突出端，所述突出端包含与所述寡核苷酸尾互补的序列；

d)通过与所述3'突出端序列进行的互补碱基配对而使所述部分双链核酸序列与所述寡核苷酸尾退火；以及

e)将所述部分双链核酸序列的正义链的5'末端与所述寡核苷酸尾的3'末端进行连接，由此将包含一个或多个能够发射或产生可检测信号的标记分子的核酸标记分子连接于所述RNA分子的3'末端，从而产生经过标记的靶RNA分子。

7.根据权利要求6所述的方法，其中所述单链RNA分子是miRNA分子。

8.根据权利要求7所述的方法，其中所述核酸标记分子是经过多重标记的聚合物骨架，其上连接有能够发射或产生可检测信号的多个标记分子，其中所述经过多重标记的聚合物骨架包含寡核苷酸延伸序列，所述寡核苷酸延伸序列包含5'磷酸基团并且能够与所述部分双链核酸序列的反义链杂交结合，其中所述经过多重标记的聚合物骨架是具有多个单链区域的树状多核苷酸组合物，所述单链区域可与一个或多个经过标记的寡核苷酸杂交，所述树状多核苷酸组合物基本由两个或更多个通过以5’-3’定向的杂交而结合在一起的多核苷酸单体构成，并且其中所述经过多重标记的聚合物骨架具有约50至约350kDa的总分子量。

9.根据权利要求8所述的方法，其中所述经过多重标记的聚合物骨架是具有多个单链区域的三聚线型树状多核苷酸组合物，所述单链区域可与一个或多个经过标记的寡核苷酸进行杂交；所述线型树状多核苷酸组合物基本由通过以5’-3’定向的杂交而结合在一起的第一、第二和第三多核苷酸单体构成；各多核苷酸单体在彼此杂交结合之前均具有第一、第二和第三单链杂交区域；并且在所述线型树状多核苷酸组合物中，所述第一多核苷酸单体的第三单链杂交区域与所述第二多核苷酸单体的第一单链杂交区域杂交结合，并且所述第二多核苷酸单体的第三单链杂交区域与所述第三多核苷酸单体的第一单链杂交区域杂交结合，其中所述第一多核苷酸单体的第一单链区域能够与所述部分双链核酸序列的反义链杂交结合，并且其中所述线型树状多核苷酸组合物中的第二单链杂交区域与一个或多个经过标记的寡核苷酸进行杂交结合，所述经过标记的寡核苷酸包含一个或多个标记分子。

10.根据权利要求9所述的方法，其中所述部分双链核酸序列的反义链包含桥联寡核苷酸，所述寡核苷酸与所述经过多重标记的聚合物骨架的寡核苷酸延伸序列和所述单链RNA分子的3'末端的寡核苷酸尾均能够杂交结合。

11.根据权利要求6所述的方法，其中所述核酸标记分子之上连接有一个或多个能够发射或产生可检测信号的标记分子，其中所述核酸标记分子包含寡核苷酸延伸序列，所述寡核苷酸延伸序列包含能够与所述部分双链核酸序列的反义链杂交结合的5'磷酸基团。

12.根据权利要求11所述的方法，其中所述核酸标记分子具有约5kDa至约250kDa的分子量。

13.根据权利要求11所述的方法，其中所述核酸标记分子包含1至约15个标记分子。

14.根据权利要求11所述的方法，其中所述标记分子由生物素或荧光团组成。