[发明专利]生产具有改善的分泌效率的重组蛋白质的方法

说明书

相关申请的交叉引用

本申请要求2009年10月30日提交的美国临时申请NO.61/256,379和2010年6月2日提交的美国临时申请NO.61/350,668的权益，通过完全引用将它们的公开内容合并在此。

发明领域

本发明涉及在包括酵母细胞的真菌细胞中以提高的分泌效率生产重组蛋白质的方法和组合物。

对电子提交的序列表的引用

本申请的序列表是通过EFS-Web电子提交的，是ASCII格式的序列表，文件名为“GFIMIS00004_SEQTXT_18OCT2010.TXT”、创建日期2010年10月18日、大小861kB。通过EFS-Web提交的该序列表是说明书的一部分，通过完全引用合并在此。

发明背景

由于当前对生物治疗剂的关注，在真核细胞中表达重组蛋白质变得越来越重要，生物治疗剂是FDA管理的药物中增长最大的部分。无论生产细胞是基于CHO的哺乳动物细胞系还是糖工程化的(glycoengineered)巴斯德毕赤氏酵母(Sethuraman and Stadheim，Curr.Opin.Biotechnol.17：341-346(2006))，最大的分泌滴度都是关键的。提高蛋白质生产的许多努力集中于启动子和重组基因的拷贝数(Daly and Hearn，J.Mol.Recognit.18：1999-38(2005))，只有重组蛋白质沿着从内质网(ER)到高尔基体、随后反式高尔基网络、最后到细胞外囊泡以递送通过质膜的特定路径转运，才能实现分泌。如果重组蛋白质偏离了这个期望的途径，产量将下降。

与哺乳动物细胞相比，糖工程化的酵母提供了用于治疗剂开发的独特的优势。例如，基于哺乳动物细胞的系统的糖基化分布是异源的(Li et al.，Nat.Biotechnol.24：210-15(2006))，而糖工程化的巴斯德毕赤氏酵母被证明提供了均匀的糖基化(Hamilton et al.，Science 313：1441-43(2006))。虽然哺乳动物糖基化的遗传学修饰是可能的，例如，消除海藻糖(Shinkawa et al.，J.Biol.Chem 278：3466-73(2003))，大多数糖形式选择必需在发酵和/或纯化步骤时发生，常常限制产量。酵母菌中遗传操作的容易性提供了与哺乳动物宿主细胞相比、独立于发酵和纯化来改善蛋白质产量的机会。

在酵母中，被递送到液泡的内源蛋白质被蛋白酶类降解。酵母液泡是一种细胞器，类似于哺乳动物溶酶体，对于内吞作用、蛋白质周转和营养物获取以维持细胞自我稳定是非常重要的。液泡蛋白质运输的一种机制是羧肽酶Y途径，其从反式Golgi网络(TGN)递送蛋白质。在酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中，对TGN中羧肽酶Y的起始相互作用负责的蛋白质受体被称为Vps10(也称为Pep1或Vpt1)、Vth1和Vth2。在酿酒酵母中，Vps10起作用来将居于液泡中的蛋白酶递送到前液泡区室，引起液泡中最终的蛋白水解作用(综述参见，Bowers and Stevens，Biochim.Biophys.Acta 1744：438-54(2005)；Li and Kane，Biochim.Biophys.Acta.1983：650-663(2009)，epub Aug.2008)。