[发明专利]生产具有改善的分泌效率的重组蛋白质的方法

权利要求书

1.一种相对于野生型巴斯德毕赤氏酵母细胞缺乏液泡分选活性或具有降低的液泡分选活性的巴斯德毕赤氏酵母细胞，其中所述宿主细胞包含液泡蛋白质分选受体10-1(VPS10-1)的功能性删除。

2.权利要求1的巴斯德毕赤氏酵母细胞，其中所述细胞包含表达载体，所述表达载体包含编码异源蛋白质的核苷酸的序列。

3.权利要求2的巴斯德毕赤氏酵母细胞，其中所述异源蛋白质是糖蛋白。

4.权利要求3的巴斯德毕赤氏酵母细胞，其中所述细胞被修饰以表达糖蛋白，在所述糖蛋白中糖基化模式是人类样的。

5.权利要求1-4的任一项的巴斯德毕赤氏酵母细胞，其中编码VPS10-1的基因被删除，以及编码VPS10-2的基因不被删除。

6.权利要求1-4的任一项的巴斯德毕赤氏酵母细胞，其中编码VPS10-1的基因包含使得编码的Vps10-1蛋白质无功能或没有液泡分选活性的突变。

7.权利要求1-4的任一项的巴斯德毕赤氏酵母细胞，其中所述Vps10-1活性的功能性删除包括选自以下构成的组的改变：VPS10-1基因的上游或下游调节序列的删除或破坏，通过Vps10-1蛋白质的化学、肽或蛋白质抑制物的液泡分选活性的取消，通过基于核酸的表达抑制物的液泡分选活性的取消，以及通过转录抑制物的液泡分选活性的取消。

8.一种在酵母或真菌宿主细胞中生产重组蛋白质的方法，包括：

a.用编码蛋白质的表达载体转化遗传修饰的酵母或真菌细胞来产生宿主细胞，其中相对于相同物种的未修饰的酵母或真菌细胞，所述遗传修饰的酵母或真菌细胞缺乏液泡分选活性，或具有降低的液泡分选活性；

b.在诱导发酵条件中蛋白质表达的条件下在培养基中培养所述转化的酵母或真菌宿主细胞；以及

c.从所述转化的宿主细胞或培养基分离所述蛋白质。

9.权利要求8的方法，其中所述酵母或真菌宿主细胞选自以下构成的组：巴斯德毕赤氏酵母、酿酒酵母、黑曲霉、粟酒裂殖酵母、白色念珠菌、光滑念珠菌、树干毕赤酵母、汉逊德巴利酵母、乳酸克鲁维酵母和多形汉逊酵母。

10.权利要求8或9的方法，其中通过从酵母或真菌细胞基因组中删除或破坏编码VPS10或VPS10同源物的基因，来消除或降低液泡分选活性。

11.权利要求10的方法，其中所述酵母或真菌宿主细胞是巴斯德毕赤氏酵母。

12.权利要求11的方法，其中VPS10同源物VPS10-1被删除。

13.一种在毕赤氏酵母宿主细胞中生产重组蛋白质的方法，包括：

a.用编码蛋白质的表达载体转化遗传修饰的毕赤氏酵母细胞来产生宿主细胞，其中相对于相同物种的未修饰的毕赤氏酵母细胞，所述遗传修饰的毕赤氏酵母细胞缺乏液泡分选活性，或具有降低的液泡分选活性；

b.在诱导所述蛋白质表达的条件下在培养基中培养所述转化的毕赤氏酵母宿主细胞；以及

c.从所述转化的宿主细胞或培养基分离所述蛋白质。

14.权利要求13的方法，其中所述宿主细胞是巴斯德毕赤氏酵母宿主细胞。

15.权利要求14的方法，其中所述遗传修饰的巴斯德毕赤氏酵母细胞包含VPS10-1的删除。

16.权利要求8-11的任一项的方法，其中所述遗传修饰的宿主细胞包含Vps10或Vps10同源物的细胞质结构域的改变，所述改变改变它的正常运输模式。

17.权利要求8或权利要求9的方法，其中通过删除或破坏与CPY液泡分选途径相关的一种或更多种基因来降低或消除液泡分选活性，其中所述一种或更多种基因编码选自以下构成的组的蛋白质：Gga1、Gga2、Mvp1、Pep12、Vps1、Vps8、Vps9、Vps15、Vps21、Vps19、Vps34、Vps38、Vps45和Vti1。