[发明专利]使用双链核酸复合物与耐热聚合酶用于合成脱氧核糖核苷酸链的组合物和方法

说明书

相关申请

本申请要求由Stephen Picone等人在2009年11月6日提交的题为“使用双链核酸复合物与耐热聚合酶用于合成脱氧核糖核苷酸链的组合物和方法”的美国临时申请号61/258,684的优先权。

将上述申请的全部教导以引用方式并入本文。

背景技术

DNA聚合酶为催化脱氧核糖核苷酸聚合为核酸链的酶。在多种DNA技术中使用聚合酶，包括PCR扩增，即复制或扩增DNA链的过程。一些PCR方法的重要问题是非特异性扩增产物的产生（例如，产生不想要的DNA链）。在许多情况下，这是由于非特异性寡核苷酸引发和副反应的非靶寡核苷酸的产生，如背景DNA的错误引发和/或在实际的热循环过程自身之前引物的低聚化以及随后的引物延伸事件。由于耐热DNA聚合酶在环境温度下具有适当的活性，这经常发生。

为了使该问题减少至最低程度，可进行称为“热启动”PCR的方法。在热启动PCR中，将扩增反应所需的一种成分从反应混合物中分离或使其保持非活性状态，直到首次将反应混合物的温度升高。由于聚合酶在这些条件下不能发挥作用，因此在引物能够非特异性结合的时期引物延伸较少。为了达到该效果，已经采用了几种方法：DNA聚合酶的物理分离（例如，使用固体蜡屏障以将DNA聚合酶与反应混合物分离），DNA聚合酶的化学修饰（例如，使DNA聚合酶可逆地失活），聚合酶DNA抗体（polymerase DNA antibody）（例如，在室温环境下结合并在扩增过程中在较高温度下分离的抗体），通过核酸添加物的DNA聚合酶抑制，适体（例如，可充当抗体的形成环、假结体、和复杂三级结构的核苷酸的单链形式），阻断引物等。这些方法中的多种不方便或运行不能达到使非特异性扩增最小化的所需效果。

因此，需要存在独特且可替换的组合物和方法用于扩增反应，其不仅在扩增过程自身之前，而且在热循环过程期间可提供非特异性引发和引物延伸的抑制。更具体而言，需要存在可替换和改进的组合物及方法用于热启动PCR。

发明内容

本发明涉及用于核酸扩增的阻断双链核酸复合物（DSC）。在一个实施方式中，复合物包括分离的双链核酸分子，所述分离的双链核酸分子包括具有包括约9至约40个之间核酸碱基的第一序列的第一核酸链；以及具有包括与第一序列互补的约9至约40个之间核酸碱基的第二序列的第二核酸链（核酸第二链），其中所述第一核酸链和第二核酸链各自具有3’端和5’端，并且其中双链核酸分子具有在约50%至约70%之间范围内的胞嘧啶（C）和鸟嘌呤（G）的百分比。双链核酸复合物也包括阻断分子，其中所述阻断分子共价结合于第一核酸链、第二核酸链、或两者的3’端或5’端。在一个方面，双链核酸分子（例如DNA或RNA）具有在约25°C至约90°C之间范围内的解链温度。在一个实施方式中，本发明的DSC进一步包括尿嘧啶碱基的引入。当使用来自古细菌种的DNA聚合酶时，向DSC中加入一个或多个尿嘧啶碱基可进一步降低室温下的聚合酶活性。特别地，DSC的第一序列或第二序列进一步包括一个或多个尿嘧啶碱基。

阻断分子的实例包括脱氧胸苷、双脱氧核苷酸、3’磷酸化（3’phosphorylation）、己二醇、间隔分子、1’2’-双脱氧核糖、2’-O-甲基RNA、和/或锁核酸（LNA）。在一个实施方式中，阻断分子具有以下结构：

反向dT。

本发明还涉及用于核酸扩增的阻断双链核酸复合物；其中所述复合物包括分离的双链核酸分子，所述分离的双链核酸分子包括具有包括约9至约40个之间核酸碱基的第一序列的第一核酸链，以及具有包括与第一序列互补的约9至约40个之间核酸碱基的第二序列的第二核酸链，其中所述第一核酸链和第二核酸链各自具有3’端和5’端，并且双链核酸分子具有在约25°C至约90°C之间范围内的解链温度。该实施方式包括阻断分子，所述阻断分子共价结合于第一核酸链、第二核酸链、或两者的3’端或5’端。在一个方面，第一序列或第二序列进一步包括一个或多个尿嘧啶碱基。