[发明专利]RNA指数式扩增的方法以及RNA反应器

说明书

技术领域

本发明涉及一种采用引物非依赖性RNA依赖性的RNA聚合酶(RdRp)进行RNA指数式扩增的方法，其中反应物进行预混，然后转移至反应室中，进行互补链的聚合反应以及产物双链RNA的分离。本发明还涉及一种用于实现RNA指数式扩增的RNA反应器。

背景技术

与采用PCR进行DNA扩增的方法相比，现有的RNA扩增方法存在多种缺陷：使用T7聚合酶进行mRNA扩增的方法(SMART^TM mRNA扩增试剂盒使用指南，Clontech Laboratories，Inc.，2008年4月28日；US 5,962,271，US 5,962,272)包含以下复杂又耗时的酶催化步骤：

1)以待扩增的RNA为模板逆转录进行双链cDNA的合成。该反应通常需要加入引物依赖性RNA依赖性的DNA聚合酶，例如来源于禽成髓细胞瘤病毒(AMV)或鼠科白血病病毒(Molooney Murine Leukemia Virus(MuLV)。

2)以合成的双链DNA为模板采用T7聚合酶催化合成RNA。该T7聚合酶是一种引物依赖性DNA依赖性的RNA聚合酶，并且要求在引物序列中具有T7特定启动子序列用于引发聚合反应。

采用T7聚合酶催化的RNA扩增呈线性增长。

另一种被提出应用于RNA扩增的酶为Qβ复制酶(参见WO 02/092774A2)。该Qβ复制酶是一种RNA依赖性的RNA聚合酶，同样要求具有特定序列识别位点的引物用于引发聚合反应。这种采用Qβ复制酶催化的RNA扩增同样呈线性增长。

此外，使用来自于噬菌体Phi-6到Phi-14的聚合酶进行RNA的扩增要求特定启动子序列的出现。Phi-6到Phi-14的酶是一种RNA依赖性的RNA聚合酶。但是采用这种酶催化的RNA扩增同样只是呈线性增长。

专利WO 2007/12329A2公开了一种使用杯状病毒科家族的RdRp(RNA依赖性的RNA聚合酶)进行制备和标记RNA的方法。该作者示出了以单链RNA(ssRNA)为模板，在具有或缺乏RNA合成引发寡核苷酸(长度少于10nt的寡核苷酸引物)的情况下，均成功地实现了RNA合成的重复循环以及双链RNA(dsRNA)产物的变性。在专利WO 2007/12329A2中也并没有出现RNA的指数式扩增。

发明内容

本发明所要解决的技术问题就是提供一种实现RNA指数式扩增的高效方法。

上述技术问题的解决方案通过权利要求中限定的本发明的实施例来提供。

特别是，根据本发明的第一方面，本发明提供了一种实现RNA指数式扩增的方法，包括以下步骤：

(a)在一个混合室中将单链RNA(ssRNA)，引物非依赖性RNA依赖性的RNA聚合酶(RdRp)，NTPs(例如，核苷酸rATP，rCTP，rGTP和rUTP(rNTPs)和/或修饰，和/或标记的rNTPs，和/或脱氧核苷酸(dNTPs)，和/或修饰的，和/或标记的dNTPs)，反应缓冲液，以及，可选地，RNA合成引发寡核苷酸进行混合；

(b)将步骤(a)中的混合物转移至反应室中；

(c)可选地，将所述RNA合成引发寡核苷酸退火到所述ssRNA上；

(d)在所述反应室中将所述混合物在一定条件下温育，使得引物非依赖性RdRp从头合成出一条与所述ssRNA互补的RNA链，或者，可选地，所述RdRp通过延伸杂交到所述ssRNA上的所述RNA合成引发寡核苷酸(寡核苷酸引物)从而形成双链RNA(dsRNA)；

(e)将在步骤(d)中合成的所述dsRNA链分离成ssRNA；

(f)在所述混合室中将引物非依赖性RdRp，NTPs，反应缓冲液，以及，可选地，寡核苷酸引物进行混合；

(g)将所述步骤(f)中的混合物转移至所述反应室中；

(h)重复步骤(d)-(g)，或者，可选地，(c)-(g)，至少5次，优选为5-100次；

(i)实行最终的温育步骤(d)从而形成终产物dsRNA；以及，可选地，

(j)从所述反应室中回收所述终产物dsRNA。