[发明专利]RNA指数式扩增的方法以及RNA反应器

权利要求书

1.一种RNA指数式扩增的方法，包括以下步骤：

(a)在混合室中将单链RNA，引物非依赖性RNA依赖性的RNA聚合酶(RdRp)，NTPs，反应缓冲液，以及，可选地，RNA合成引发寡核苷酸混合；

(b)将步骤(a)中的混合物转移至反应室；

(c)可选地，将所述RNA合成引发寡核苷酸退火到所述单链RNA上；

(d)在所述反应室中将所述混合物在条件下温育，使得引物非依赖性RdRp从头合成出与所述单链RNA互补的RNA链，可选地，所述RdRp延伸杂交到所述单链RNA上的RNA合成引发寡核苷酸从而形成双链RNA；

(e)将步骤(d)中形成的所述双链RNA分离成单链RNA；

(f)在混合室中将引物非依赖性RdRp，NTPs，反应缓冲液，以及，可选地，RNA合成引发寡核苷酸混合；

(g)将步骤(e)中的混合物转移至所述反应室中；

(h)重复步骤(d)-(g)，或者，可选地，(c)-(g)至少5次；

(i)进行最终的温育步骤(d)从而合成终产物双链RNA，以及，可选地，

(j)从所述反应室回收所述终产物双链RNA。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(h)中重复步骤(d)-(g)，或者，可选地，(c)-(g)5-100次。

3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述引物非依赖性RdRp具有“右手构象”，所述RdRp的氨基酸序列包含以下基序的保守区域：

a.XXDYS

b.GXPSG

c.YGDD

d.XXYGL

e.XXXXFLXRXX

具有以下含义：

D：天冬氨酸

Y：酪氨酸

S：丝氨酸

G：甘氨酸

P：脯氨酸

L：亮氨酸

F：苯丙氨酸

R：精氨酸

X：任何氨基酸

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述引物非依赖性RdRp是一种杯状病毒科家族的RdRp。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述引物非依赖性RdRp是一种诺沃克病毒，沙波病毒，猪水泡疱疹病毒，或兔出血症病毒的RdRp。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述引物非依赖性RdRp是一种选自于诺沃克病毒菌株HuCV/NL/Dresden174/1997/GE(GenBank登录号为AY741811)的RdRp，或者沙波病毒菌株pJG-Sap01(GenBank登录号为AY694184)的RdRp，或者猪水泡疱疹病毒菌株FCV/Dresden/2006/GE(GenBank登录号为DQ424892)的RdRp。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述引物非依赖性RdRp具有选自于SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：3，SEQ ID NO：4，SEQ ID NO 5，SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：7的氨基酸序列。

8.如前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，ssRNA模板具有15-30，优选为21-28，更优选为21-23个核苷酸的长度。

9.如权利要求1-7中任一项所述的方法，其特征在于，所述ssRNA模板具有超过30个核苷酸的长度。

10.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述ssRNA模板是mRNA。

11.如前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，步骤(d)和(f)中的反应体积在每个循环步骤(h)中加倍。

12.如权利要求1-10中任一项所述的方法，其特征在于，所述步骤(f)和(g)在第2至第10个循环的步骤(h)中进行。

13.如权利要求13所述的方法，其特征在于，所述步骤(d)和(f)中的反应体积在每个循环步骤(h)中加倍，所述循环步骤(h)中进行所述步骤(f)和(g)。

14.如前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，所述步骤(a)和/或(f)在2-8℃下进行，优选为4℃。