[发明专利]靶向修饰的纯合生物体

说明书

相关申请的交叉参考

本申请要求2009年8月11日提交的美国临时申请第61/273,928号的权益，通过引用将该申请全文纳入本文。

联邦资助研究下所作发明的权利声明

无。

技术领域

本发明涉及就一个或多个内源基因的靶向修饰而言为纯合的生物体。更具体地，本发明涉及生物体(例如，植物或动物)，其中某基因的两条等位基因都被打断但其中该纯合敲除生物体在打断的基因座处不含外源序列。本发明还涉及生物体(例如植物或动物)，其中某基因的两条等位基因都由转基因的插入而被修饰，其中所述转基因缺乏编码报道子(如选择性标记)的序列。

背景技术

具有纯合靶向基因修饰的生物体(例如，植物和动物)可用于多种农业、药物和生物技术应用。这些生物体通常通过在所选进行修饰的基因处引发所需序列(供体)的同源重组体而产生。但是，为了选择供体DNA已纳入靶基因座的细胞，靶载体必须同时包括正选择和负选择标记。参见例如，美国专利号5,464,764。选出的细胞产生杂合子，必须杂交以获得就基因修饰而言纯合的生物体。通过该过程，选择性标记仍整合在生物体基因组内，使得所得经修饰纯合子同时包括带修饰的基因和外源(如标记)序列。

近来，经工程改造以特异性结合靶向位点的核酸酶，包括锌指核酸酶和寻靶(homing)核酸内切酶如I-SceI，已经成功用于多种不同物种的基因组修饰。参加例如，美国专利公开20030232410；20050208489；20050026157；20050064474；20060188987；20060063231；2008/0182332；2009/0111188和国际公开WO07/014275，通过引用将这些公开全文纳入本文用于所有目的。这些ZFN可用来在靶核苷酸序列中产生双链断裂(DSB)，该断裂使通过在靶向基因座同源重组(靶向整合)的供体核酸引入频率提高超过1000倍。此外，通过非同源末端连接(NHEJ)对位点特异性DSB的不准确修复也可导致靶向基因破坏。

尽管如此，与非核酸酶方法一样，为了在很多生物体中方便地识别核酸酶介导的修饰，包括选择性标记或报道基因在内的外源DNA也靶向所选基因座。参见例如，Shukla等(2009)Nature 459(7245)：437-441；美国专利公开序列号2008/0182332和2009/0111188。尽管报道子的靶向整合能鉴定多种应用的修饰，该技术不总是理想的，因为其留下插入基因组的额外外源核酸序列。

因此，仍需要组合物与方法用于产生在所需基因的基因座修饰的纯合生物体，包括在靶向修饰的基因座不含插入外源序列的纯合KO生物体和不含编码报道子如选择性标记的序列的纯合转基因生物体。

发明内容

本文描述了在所需基因座含有修饰的纯合生物体以及用于产生这些生物体的方法和系统。带修饰的生物体包括在靶向修饰的基因座处没有插入外源序列的纯合KO生物体，和没有编码报道子(如选择性标记)的序列的纯合转基因生物体。

一方面，本文提供包含至少一个基因座的带修饰生物体，所述基因座的两条等位基因都被修饰(例如，被打断)，但所述修饰生物体在经修饰基因座处不含外源序列。在其它实施方式中，如本文所述的生物体可在任意未破坏(敲除)基因座处包含一个或多个转基因(外源序列)。

另一方面，本文提供包含至少一个基因座的修饰生物体，所述基因座的两条等位基因都包含转基因，其中所述转基因不包含报道子如筛选或选择性标记。另一方面，本文提供包含至少一个基因座的修饰生物体，所述基因座的所有等位基因(例如，在三倍体或四倍体生物中)都包含转基因，其中所述转基因不包含报道子如筛选或选择性标记。

本文描述的任意生物体可包含超过一种双等位基因(或多等位基因)修饰(例如，破坏或转基因)。此外，所述生物体可以是例如真核生物(例如，植物或动物，如哺乳动物，例如大鼠、小鼠或鱼)。