[发明专利]靶向修饰的纯合生物体

权利要求书

1.一种生物体，其就某基因座处的修饰而言为纯合，所述基因座具有至少第一和第二等位基因，其中

(i)所述基因座的第一和第二等位基因包含一种或多种缺失使得所述基因失活，并且其中所述第一和第二等位基因不含有外源序列；或者

(ii)所述基因座的第一和第二等位基因包含一种或多种外源序列，其中所述一种或多种外源序列不编码报道子或选择性标记。

2.如权利要求1所述的生物体，其特征在于，所述第一和第二等位基因包含一种或多种缺失使得所述基因座失活。

3.如权利要求1所述的生物体，其特征在于，所述第一和第二等位基因包含不编码报道子或选择性标记的一种或多种外源序列。

4.如权利要求1-3中任一项所述的生物体，其特征在于，所述生物体是植物或动物。

5.如权利要求4所述的生物体，其特征在于，所述植物选自玉米、大米、小麦、马铃薯、大豆、番茄、烟草、芸苔属的成员、和拟南芥。

6.由权利要求4或5所述植物产生的种子。

7.如权利要求4所述的生物体，其特征在于，所述动物是哺乳动物。

8.产生如权利要求1、2或4-7中任一项所述纯合生物体的方法，其中，所述纯合生物体在选定的靶基因座处缺乏外源序列，所述方法包括：

(a)用核酸酶将外源序列引入细胞，所述核酸酶介导所述外源序列靶向整合入所述生物体基因组的选定基因座内，所述基因座含有至少第一和第二等位基因；

(b)鉴定包含以下元件的细胞：(i)所述靶基因座第一等位基因中的所述外源序列以及(ii)选定靶基因座的第二等位基因中的非同源末端连接(NHEJ)修饰；

(c)使步骤(b)中鉴定出的细胞发育至繁殖上成熟的生物体；

(d)将所述繁殖上成熟的生物体彼此杂交；以及

(e)鉴定在所述选定靶基因座的第一和第二等位基因处呈现NHEJ修饰的子代，从而产生在选定靶基因座缺乏外源序列的纯合生物体。

9.产生权利要求1或3-7中任一项所述生物体的方法，其中，所述生物体就基因组选定靶基因座处的一种或多种外源序列而言为纯合，其中所述外源序列在选定靶基因座处不含报道子或选择性标记，所述方法包括：

(a)用核酸酶将报道子或选择性标记序列引入所述生物体的细胞内，该核酸酶介导所述报道子靶向整合入所述基因组的选定靶基因座内，所述选定靶基因座包含至少第一和第二等位基因；

(b)将一种或多种外源序列引入细胞，其中所述核酸酶介导外源序列靶向整合入基因组的选定靶位点内；

(c)鉴定含有以下元件的细胞：(i)选定靶基因座的第一等位基因中的所述报道子或选择性标记和(ii)第二等位基因中的所述一种或多种外源序列；

(d)使步骤(c)中鉴定出的细胞发育至繁殖上成熟的生物体；

(e)将所述繁殖上成熟的生物体彼此杂交；以及

(f)鉴定步骤(e)的杂交中在所述第一和第二等位基因处包含所述一种或多种外源序列的子代，从而产生就外源序列而言纯合的且在选定靶基因座缺乏报道子/选择性标记序列的生物体。

10.如权利要求8或9所述的方法，其特征在于，所述核酸酶选自一种或多种锌指核酸酶(ZFN)；一种或多种大范围核酸酶和一种或多种TAL-效应子结构域核酸酶。

11.如权利要求8-10中任一项所述的方法，其特征在于，所述报道子或选择性标记序列和所述一种或多种外源序列是用一种或多种核酸酶同时或依序引入。

12.如权利要求8-11中任一项所述的方法，其特征在于，所述报道子序列包含选择性或筛选标记。

13.如权利要求8-12中任一项所述的方法，其特征在于，所述一种或多种核酸酶作为多核苷酸引入。