[发明专利]无甘油的乙醇发酵生产

说明书

本发明涉及一种酵母细胞，尤其涉及一种重组酵母细胞，所述细胞缺乏NADH依赖的甘油合成所需的酶活性，或者与所述细胞相应的野生型酵母细胞相比，所述细胞具有降低的与NADH依赖的甘油合成有关的酶活性；所述细胞包括一个或多个编码NAD⁺依赖的乙酰化乙醛脱氢酶(EC 1.2.1.10)活性的异源核酸序列。本发明进一步涉及根据本发明的细胞在乙醇制造中的用途。

技术领域

本发明涉及一种具有生产理想发酵产品能力的重组酵母细胞、通过基因改造构建所述酵母细胞、以及一种使用所述酵母细胞生产发酵产品的工艺。

背景技术

按体积计，目前利用酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)生产乙醇是工业生物技术中一种最大规模的发酵工艺。正在进行的一项全球性研究工作的目的是：扩大酿酒酵母的底物范围，以使该底物能够包括木质纤维素水解产物，尤其是能够包括来自非食品原料(如富含纤维素、半纤维素和/或果胶的能源作物、农业残留物、林业残留物或工业/消费者废物)的木质纤维素生物质的水解产物，从而提高生产能力、稳健性和产品产量。

木质纤维素生物质是丰富的，然而通常情况下，野生型生产乙醇的微生物比如酿酒酵母并不易于对该木质纤维素生物质进行发酵。该生物质必须先进行水解，水解产物常常是各种单糖和寡糖的混合物，且并非所有这些产物都是野生型微生物的适宜底物。进一步地，该水解产物通常包含乙酸，尤其在水解果胶或半纤维素时会形成作为副产物的乙酸；依赖于水解类型，该水解产物还包含一种或多种其他副产物、或对发酵可能有不利影响的残留试剂。尤其是，据报道，乙酸对野生型和基因改造型酿酒酵母菌株进行糖发酵的动力学和/或化学计量学有不利影响，并且在培养基pH值较低时会大大增强乙酸的毒性(Helle等Enzyme Microb Technol 33(2003)786-792；Bellissimi等FEMS Yeast Res 9(2009)358-364)。

现已提出了各种方法，以通过基因改造来改善生产乙醇生物体的发酵性能、以及改善生物质水解工艺。例如，A.van Maris等以综述形式给出了由生物质水解产物进行乙醇发酵生产的进展概述(Antonie van Leeuwenhoek(2006)90：391-418)。其中，引用了酿酒酵母各种可能的改造方式和各种水解木质纤维素生物质的方法。

与基于酵母进行乙醇生产的化学计量学相关的主要挑战是：总会以副产物的形式形成大量甘油。据估计，在典型的工业乙醇生产工艺中，会有高达约4％(重量)的糖原料转化成甘油(Nissen等Yeast 16(2000)463-474)。在厌氧生长的理想条件下，转化为甘油的糖原料甚至会更高，如高达约10％。

厌氧条件下的甘油生成，主要与氧化还原代谢相关。在酿酒酵母的厌氧生长过程中，通过乙醇发酵发生糖异化作用。该过程中，在糖酵解的甘油醛-3-磷酸脱氢酶反应中形成烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)；通过丙酮酸的脱羧作用形成的乙醛经由NAD⁺依赖的乙醇脱氢酶转化成乙醇，同时NADH通过该过程被再氧化。当NAD⁺至NADH的纯还原反应发生在代谢的其他地方时，氧化还原中性异化途径的固定化学计量学会出现问题。厌氧条件下，酿酒酵母中NADH的再氧化严格依赖于糖至甘油的还原反应。由糖酵解中间产物二羟丙酮磷酸至3-磷酸甘油的还原起始甘油的形成；其中，由NAD⁺依赖的甘油3-磷酸脱氢酶催化二羟丙酮磷酸至3-磷酸甘油的还原反应。随后，该反应中形成的3-磷酸甘油被甘油3-磷酸酶水解，产生甘油和无机磷酸。因此，甘油是利用酿酒酵母进行乙醇厌氧生产过程中的主要副产物，而这是不期望的，因为甘油的生成降低了糖至乙醇的整体转化。进一步地，乙醇生产厂废水中存在的甘油，可能会带来废水处理的成本。

发明内容

本发明的一个目的在于提供一种新的重组细胞，所述重组细胞适合由碳水化合物、尤其是从木质纤维素生物质获得的碳水化合物进行乙醇的厌氧发酵生产；当所述重组细胞用于乙醇的发酵生产时，与所述重组细胞相应的野生型生物体相比，所述重组细胞生成的甘油降低，或者缺乏甘油的生成。