[发明专利]监视亚硫酸氢盐介导的DNA转化的方法

说明书

发明领域

本发明涉及在DNA甲基化分析期间监视亚硫酸氢盐介导的DNA转化的发展的方法。所述方法基于酶尿嘧啶-DNA-糖基化酶（UNG）与至少一种标记的DNA报告分子的反应，所述报告分子在其序列中包含至少一个未甲基化的胞嘧啶残基。在尿苷残基中未甲基化的胞嘧啶残基的亚硫酸氢盐介导的转化之后，UNG从DNA骨架中除去尿嘧啶碱基，因而使得它对热诱导的水解切割敏感。最后，检测在这种断裂过程期间从DNA报告分子上释放的标记物。

尿嘧啶-DNA糖基化酶和尿嘧啶-N-糖基化酶有时缩写为UNG或UDG，它们应被理解为相似的或同义的。在任何情况下，在本申请中使用该术语来指明使得DNA骨架对热诱导的水解切割敏感的酶。

发明背景

DNA甲基化在各种生物体包括原核生物和真核生物的基因组中存在。在原核生物中，DNA甲基化在胞嘧啶和腺嘌呤碱基上发生，并涵盖了宿主限制系统的一部分。然而在多细胞真核生物中，甲基化看起来限于胞嘧啶碱基，并且与被抑制的染色质状态和基因表达抑制相关（例如，在Wilson, G.G. and Murray, N.E.（1991）Annu. Rev. Genet. 25, 585–627中综述）。

在哺乳动物细胞中，DNA甲基化主要在CpG二核苷酸处发生，其不均匀地分布，并且在基因组中减量出现（underrepresented）。在许多启动子区域中发现了通常未甲基化的CpGs的簇（称为CpG岛）（例如，在Li, E.（2002）Nat. Rev. Genet. 3, 662-673中综述）。已经在几种人类癌症中证明了引起异常的基因沉默的DNA甲基化的改变（例如，在Robertson, K.D. and Wolffe, A.P.（2000）Nat. Rev. Genet. 1, 11-19中综述）。证明了启动子的超甲基化是引起肿瘤阻抑基因灭活的常见的机制（Bird, A.P.（2002）Genes Dev. 16, 6-21）。

存在各种方法用于实验上测定个体基因中的差异性甲基化（例如，在Rein, T. et al.（1998）Nucleic Acids Res. 26, 2255-2264中综述）。这些技术尤其地包括亚硫酸氢盐测序、甲基化特异性PCR（MSP）、Methylight和焦磷酸测序。

进行上述技术的一个共同的先决条件是要分析的DNA的亚硫酸氢盐介导的转化（也称为亚硫酸氢盐修饰）。特别地，未甲基化的胞嘧啶残基被转变为尿苷残基。从胞嘧啶到尿嘧啶的亚硫酸氢盐介导的转化的三步骤反应方案在图1中示意地显示。简言之，在微酸性条件下胞嘧啶被磺化为胞嘧啶亚硫酸氢盐。自发地发生水解脱氨成为尿嘧啶-亚硫酸氢盐。后者然后在碱性条件下脱磺酸成尿嘧啶。

由于在亚硫酸氢盐处理期间甲基化的胞嘧啶残基不被转化为尿苷残基，未甲基化的CpG岛中的DNA序列被有效地改变（C到U），而甲基化的DNA保持了它的原始序列。

然而，对于基于DNA甲基化状态分析的有效的诊断结果，希望的是DNA以最大效率转化，也就是说理想地，给定DNA序列中存在的100%的未甲基化的胞嘧啶残基转化为尿苷残基。

亚硫酸氢盐介导的DNA转化一般使用商业上可获得的反应试剂盒进行。在这些测试系统中，DNA通常在相对高的反应温度（例如，60℃）下孵育长时间（在很多情况下，过夜）。在孵育的这个时间期间，重复的加热步骤到95℃是变性DNA所必需的。在很多情况下，通过简单地使得反应运行看来适当的尽量多次，孵育时间应当达到最高的DNA转化效率，和/或孵育时间是可容忍的，同时维持一定水平的DNA质量。另一方面，还明显的是，延长的加热时期最后引起DNA的降解，因而引起DNA产量和完整性的降低。这对于任何下游的分析可能是致命的，例如，如果样品中的DNA浓度低的话。

然而，要分析的不同的样品DNA或不同的应用可能需要独特的实验设置，以实现最大效率。例如，与纯化的样品DNA相比，使用具有非纯化DNA的粗溶胞产物具有更高的不确定性。在粗溶胞产物中，存在着可能潜在地与亚硫酸氢盐相互作用的其他物质，因而干扰DNA转化反应。

鉴于上述考虑，“一个孵育时间满足所有情况”的一般方法显然是不合理的，因为当分析易于转化的DNA样品（例如，纯化的DNA分子）时，这将由于延长的热暴露而引起不必要的DNA质量损失。反之亦然，即使有的话，复杂样品（例如，粗溶胞产物、体液、冷冻的活检组织）中的DNA可能仅相当小程度地被转化。