[发明专利]用于分离胎盘来源微粒的方法和试剂盒以及它们用于诊断胎儿疾病的应用

说明书

技术领域

在一些实施方式中，本发明涉及从母体血液样品中分离胎盘来源微粒的方法和试剂盒以及它们用于描绘胎儿特征的应用。

背景技术

在怀孕期间通常要进行产前筛查以检测潜在的先天缺陷(如唐氏综合征、染色体异常、遗传病和其它状况)。优选地在怀孕的早期进行筛查。由多余的或缺失的染色体(非整倍体)引起的综合征是人类最广泛被识别的遗传病并且目前可以使用如羊膜穿刺术和绒毛膜绒毛取样(CVS)的方法进行检查。但是，尽管能预测染色体畸变，所述羊膜穿刺术或CVS方法分别带来了0.5-1％或2-4％的方法相关的流产风险。

微囊泡(MV)包括微粒和外来体，其在正常生理状况的血液循环中出现并在多种疾病中增加。微粒(MP)是从多种细胞表面脱落的膜囊并包含少量的细胞质物质。细胞微粒由细胞骨架结构重排形成，其尺寸多样化(大约0.1至1μm)并且在磷脂和蛋白组合物中有差异。MP包含DNA和RNA(Reich CF等Exp Cell Res.(2009)10；315：760-8)并且暴露特异于它们源于的细胞的膜抗原(Diamant等，Eur J Clin Invest(2004)34：392-401)。例如，在循环中，有脱落自血小板、内皮细胞或白细胞的MP。在癌症患者中，可以检测到肿瘤细胞来源MP，在孕妇中可以发现胎盘来源MP。

在暴露于细胞因子或毒素之后及在多种病理学(如炎症、癌症、糖尿病和其它血管疾病)中，有两种导致微粒形成的机制——细胞凋亡或激活。在血液中，MP看来似乎是具有膜结构的RNA的主要来源，所述膜结构保护核酸不被血液核酸酶消化。此外，循环的微粒通过在细胞间转移蛋白和RNA(如微小RNA)调节靶细胞及促进细胞与细胞的交互作用，因此提高靶细胞膜上的蛋白表达并诱导细胞信号转导。

循环的核酸可以提供诊断和预后意义的标记物。血液中的MP可以包含来自它们起源细胞(如肿瘤)的mRNA，所述mRNA的形式是可以被基因组技术分析的形式。在妊娠中，细胞外mRNA提供了用于评估胎儿基因表达的材料来源(Ng EK等，Proc Natl Acad Sci U S A.(2003)15；100)。

滋养层细胞起始是作为早期胎儿胚细胞的外部覆盖层，其提供了母体子宫内膜和发育胚胎之间的营养途径。覆盖胎盘绒毛(vili)的人类绒毛膜滋养层细胞(HVT)提供了用于与母体循环交换氧气和营养物质的表面并且它们是暴露于母体循环的具有胚胎表型的唯一细胞。胎盘滋养层细胞分化通过细胞凋亡完成并且导致了合体滋养层细胞MP释放至母体循环中。

所述合体滋养层细胞来源MP与体外循环的胎儿核酸相关[DNA and mRNA，Gupta AK等，Clinical Chemistry(2004)50：2187-2190]。合体滋养层细胞来源MP可以在起始于怀孕中期的母体循环中被检测(即，使用ELISA和抗NDOG2抗体)，它们的数量在怀孕末期时增加且它们参与正常或先兆子痫怀孕中的系统炎症反应[Germain SJ等，J Immunol.(2007)178：5949-56]。用抗NDOG1抗体标记胎盘来源MP并用流式细胞术评估[Aharon A等.J Thromb Haemost.2009 Mar 13]。

之前的研究描述了通过从母体血液中分离胎儿有核细胞(如红细胞)并将它们用于遗传分析来进行胎儿分析(见如美国专利号5,750,339)。

美国专利申请号20080261822描述了通过滋养层细胞的原位染色用于产前诊断的方法。根据它们的技术，从怀孕个体收集经子宫的标本并将所述标本进行滋养层细胞特异的免疫染色，随后进行基于原位DNA的遗传分析以测定胎儿性别和/或鉴定胎儿中染色体和/或DNA的异常。

其它的文献包括Orozco AF等，American Journal of Pathology(2008)173：1595-1608。

发明内容

根据本发明的一些实施方式的一个方面，提供一种产前分析胎儿的方法，所述方法包括：(a)分离胎盘来源微粒；和(b)分析胎盘来源微粒的内含物的至少一种成分，其中所述至少一种成分是胎儿特征的指示。

根据本发明的一些实施方式的一个方面，提供一种从怀孕个体获得的血液样品中分离胎盘来源微粒的方法，所述方法包括：(a)在使得至少一种试剂与胎盘来源微粒结合的条件下，用至少一种试剂接触所述血液样品，其中所述至少一种试剂与胎盘来源微粒特异结合而不与母体微粒结合；和(b)分离所述胎盘来源微粒，从而从血液样品中分离胎盘来源微粒。