[发明专利]茎部加速的等温核酸扩增技术

说明书

本专利申请主张申请日为2009年6月15日的英国专利申请GB0910302.9的优先权，该英国专利申请的全部内容通过引用结合于此。

【技术领域】

本发明涉及一种核酸扩增技术，尤其涉及一种方法，该方法改善了测试样本的快速和特异扩增及检测。

【背景技术】

在许多研究和诊断领域中，核酸扩增技术(NAAT)都是一种非常宝贵和强大的工具。核酸扩增技术能够以较高的灵敏度和特异性对样本中的核酸进行检测和量化，并且能够对样本中的核酸进行量化分析。

核酸扩增可用来确定样本中是否存在特定的模板核酸，这可以通过执行特定的核酸扩增技术之后是否存在扩增产物来判断。相反，如果不存在任何扩增产物，则表明样本中不存在模板核酸。这些技术在诊断领域中至关重要，比如用来确定样本中是否存在病原体。

现有技术中具有许多用于核酸扩增的热循环和等温技术。热循环技术，比如聚合酶链式反应(PCR)通过温度循环来促进不断重复的DNA合成循环，从而导致合成了数量与模板核酸的原始数量成一定比例的大量新的DNA。已经形成了许多并不依赖热循环来促进扩增反应的等温技术。已经形成了用于不涉及RNA-合成步骤的扩增反应的等温技术，这些等温技术使用具有链置换活性的DNA聚合酶。类似地，对于涉及RNA合成步骤的扩增反应而言，已经形成了等温技术，这些等温技术可以使用逆转录酶、核糖核酸酶H和/或依赖DNA的RNA聚合酶(参见比如Nucleic Acid Isothermal Amplification Technologies-A review.Nucleosides，Nucleotides and Nucleic Acids，第27卷，2008年3月第3期，第224-243页)。

通常将通过所采用的扩增技术生成的多核酸称为扩增子。所产生的扩增子的特性针对所进行的核酸扩增技术具有较大差异。例如，核酸扩增技术比如聚合酶链式反应可能产生尺寸和序列实质上相同的扩增子。而另一些核酸扩增技术可能产生尺寸差异较大的扩增子，其中，这些扩增子由不同数量的重复序列组成，因此扩增子是不同长度的串联体的集合。这些串联体中的重复序列反映了多核酸的序列，该多核酸是所执行的实验的对象。

鉴于核酸扩增技术在许多领域中比如诊断领域中具有相当的重要性，因此，业界仍然有提供速度、灵敏度及特异性得到改善的核酸扩增技术的需求。本发明提供一种简单及成本效益划算的方法来改善速度、灵敏度及特异性。此外，本发明具有有益效果：通过本发明方法实现的速度增加能够抵消序列依赖性问题所导致的扩展速度的减小，这些序列依赖性问题导致针对特定核酸扩增技术的引物设计变得次优化。这种速度增加可进一步降低基于特定核酸扩增技术的实验成本，因为可以不必使用其他成本较高的增加扩增速度的方法。

【具体实施方式】

本发明提供一种改进的多核酸扩增方法。

因此，在一个实施例中，本发明提供一种合成多核酸的方法，该方法包括如下步骤：

a)提供包括至少第一和第二交互引物结合区的目标模板；

b)提供包括第一和第二片段的第一引物，其中所述第一片段实质上与所述模板上的第一交互引物结合区互补，并且所述第二片段包括序列，该序列实质上与第一引物中的另一个区域或第一引物的第一片段所生成的扩增子中的一个区域互补，从而使得第二片段能够形成环状物；

c)提供包括第一片段及可选的第二片段的第二引物，其中所述第一片段实质上与模板上的第二引物结合区互补，并且所述可选的第二片段包括序列，该序列实质上与第二引物中的另一个区域或第二引物的第一片段所生成的扩增子中的一个区域互补，从而使得第二区域能够形成环状物；

d)提供至少一个引物，其能够与第一和第二交互引物结合区之间的区域结合；

e)提供合成所述多核酸所必须的试剂和条件；

f)执行多核酸的合成。

本发明的潜在原理是：已经惊奇地发现提供一个或多个“茎部引物”，即，与正向交互引物结合区和反向交互引物结合区之间的区域结合的引物，能够显著增强一定的核酸扩增技术的速度和灵敏度。