[发明专利]抗原-诺罗病毒P-结构域单体和二聚体，抗原-诺罗病毒P-粒子分子，及其制备和应用方法

说明书

权益

本发明是在国立卫生院(NIH)、过敏和传染病国立研究院(经费编号R01AI37093和R01 AI055649)以及国防部(经费编号PR033018)授予江熙的政府支持下做出的。这项研究还得到了辛辛那提大学和辛辛那提儿童医院医学中心(来自临床及转化科学与培训中心的T1研究基金)对谭明的支持。此外，Nipert基金会赞助给谭明的传染病研究经费也对该研究作出了贡献。政府对本发明可能拥有某些权利。

发明领域

本发明总体上涉及诺罗病毒(NOROVIRUS，NOR)衣壳蛋白的P-结构域和NOR P-粒子；抗原-诺罗病毒P-结构域单体、抗原-诺罗病毒P-结构域二聚体和抗原-诺罗病毒P-粒子分子的制备；以及它们在抗病毒药物、药物递送系统、以及疫苗开发中的用途。

发明背景

快速发展的生物材料和生物工程领域已成为现代医学的关键组成部分。病毒蛋白笼由于其多功能性和易于形成阵列，成为建立呈递系统的理想基材。通过基因工程，自组装的病毒结构蛋白给生物材料的合成提供了优秀的平台，是外来分子以设定模式进行整合时的良好支架，其可作为疫苗或药物。

近期的一个利用病毒颗粒进行抗原呈递的例子是Manayani等描述的兽棚病毒(flock house virus，FHV)VLP与180个氨基酸的炭疽杆菌抗原插入片段构成的嵌合体。该重组病毒样颗粒既作为炭疽抗毒素，也是炭疽疫苗的分子支架，即在单个化合物中结合了炭疽抗毒素和疫苗的功能。另一个例子是Chatterji等描述的豇豆花叶病毒(Cowpea mosaic virus，CPMV)，文中包括了豇豆花叶病毒用于抗原表位呈递和作为肽和蛋白质附着基质的用途。整个蛋白质被化学交联至通过基因工程加在二十面体CPMV颗粒外壳蛋白上的赖氨酸和半胱氨酸残基。此外，包含伯氏疏螺旋体(Borrelia burgdorferi)表面抗原(OSPA)的乙肝病毒(HBV)衣壳样颗粒(CLP)也有描述。

诺罗病毒(NOR)，以前也被称为“诺瓦克样病毒”(NLV)或小圆结构病毒，在发达国家和发展中国家都是最重要的流行性急性胃肠炎的病毒病原体。这些遗传多样性的病毒包括两个主要遗传组(genogroups)(GI和GII)和大约30种基因型。NORs属于杯状病毒科(Caliciviridae)，是二十面体的单链正链RNA病毒，其衣壳由180个拷贝的单一主要结构蛋白构成。

过去，对人类NORs的生物学研究受到了阻碍，因为病毒无法有效地在细胞培养中生长，并且没有建立合适的动物模型来进行病毒复制。从疾病爆发和人类志愿者研究获得的人类粪便样本是病毒的唯一来源，但粪便中的病毒含量太低以至于用常规电子显微镜进行病毒检测是不可能的。然而，最近通过杆状病毒(主要感染昆虫的双链DNA病毒)在昆虫细胞中成功表达NOR衣壳蛋白给NORs免疫学、流行病学和病理学研究提供了有力的替代。产生的病毒衣壳蛋白单体自组装成病毒样颗粒(VLPs)。这些VLPs与人类粪便中发现的真正病毒在形态和抗原性上没有区别，因此给免疫检测和关于受体-病毒相互作用的研究提供了一个有用的工具。

重组NOR衣壳蛋白的原子结构表明，它包含180个衣壳蛋白单体组织成的90个二聚体壳微体，形成T＝3的二十面体。来自冷冻电子显微镜和X射线晶体学的数据显示，病毒衣壳蛋白折叠成两个主要结构域，N-末端壳(Shell，S)结构域和C-末端突起(Protrusion，P)结构域。S结构域形成内壳，而P-结构域建成从内壳延伸出来或者从内壳隆起的拱形结构。形态发生研究表明，S结构域包含衣壳的内壳组装所需的元件，而P-结构域二聚体亚基之间的分子相互作用增加了衣壳的稳定性。这两个结构域是通过一个8-10-残基(氨基酸)铰链连接在一起。P-结构域又分为P1和P2结构域，后者位于衣壳的最外表面。与S和P1结构域不同，P2结构域具有较高的序列变异。由于P-结构域位于病毒粒子的最外表面且包含最可变的序列，P-结构域被认为是负责与宿主的相互作用、免疫识别、受体结合和免疫反应。已经证明分离的含有铰链(但缺乏s域)的P-结构域可以体外形成二聚体，该二聚体保持与人类组织血型抗原(HBGA)受体的结合。

HBGAs是复杂聚糖和相关碳水化合物的异质群体。NORs以多样化毒株特异的方式识别人类HBGAs。在HBGAs中，最常遇到的血型是ABO(ABH)和Lewis。ABH和Lewis血型系统中抗原形成使用的生物合成途径是相互关联的。