[发明专利]包含表达增强子的真核宿主细胞

说明书

本发明涉及包含表达增强子的真核宿主细胞及其在目的蛋白(protein ofinterest，POI)生产方法中的用途。

蛋白的成功分泌已在原核和真核宿主中都有实现。最显著的例子是诸如大肠杆菌的细菌；诸如酿酒酵母、巴斯德毕赤酵母或者多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)的酵母菌；诸如泡盛曲霉(Aspergillus awamori)或者瑞氏木霉(Trichoderma reesei)的丝状真菌；或者诸如CHO细胞的哺乳动物细胞。虽然某些蛋白可以很容易地达到高水平分泌，许多其他蛋白只能以较低水平分泌(Punt et al.，2002；Macauley-Patrick et al.，2005；Porro et al.，2005)。

提高重组蛋白的分泌的一种方法是通过随机突变(Archer et al.，1994；Lang and Looman，1995)。这种方法的主要缺点是阳性结果通常不能转化到其他菌株上。

真核生物(例如酵母)的分泌途径-蛋白的折叠和加工是非常复杂的，有许多相互作用的参与成分。这些蛋白中的一些对诸如二硫键异构酶(PDI)的蛋白有催化活性，其他一些通过与蛋白结合并阻止它们聚集(分子伴侣，例如BiP)或者通过在分泌途径后面的步骤中刺激蛋白释放到细胞外部(SSO蛋白)来发挥作用。由于这种相互依赖，提高分泌途径中一个反应步骤的速率可能不会自动增加目的蛋白的分泌，而是可能导致随后一个或多个反应步骤被限速，因此不是除去了而只是转移了表达系统的瓶颈。

多个例子表明可以借助过表达被称为“辅助因子”的一类蛋白质来增强异源蛋白的分泌(Mattanovich et al.，2004)。

WO 2008/128701A2描述了用于增加从真核细胞分泌POI的表达系统，所述系统采用了选自BMH2、BFR2、C0g6、C0Y1、CUP5、IMH1、KIN2、SEC31、SSA4和SSE1的分泌辅助因子。相关基因从酿酒酵母的cDNA芯片获得。

Gasser等(Applied and Environmental Microbiology(2007)6499-6507)描述了酵母菌中鉴定能够增强异源蛋白分泌的新因子的基于转录组的方法。利用DNA芯片杂交试验发现了特异的分泌增强蛋白。

WO 93/25676中首次建议将编码POI的基因与编码异源二硫键结合蛋白的基因共表达从而作为增加异源蛋白产生的手段。WO 93/25676报道安逖斯塔辛(antistasin)和蜱抗凝血肽蛋白的重组表达可以通过与PDI共表达来提高。

WO 94/08012提供了通过增加Hsp70伴侣蛋白(即KAR2和BIP或PDI伴侣蛋白)的表达来提高酵母菌中蛋白质分泌的方法。

WO 03/057897提供了通过共表达至少两个基因来重组表达目的蛋白的方法，所述基因编码选自GroEL、GRoES、DnaK、DnaJ、GRpe，ClpB及其同源分子的伴侣蛋白。

WO 2005/0617818和WO 2006/067511提供了通过使用基于2μm的表达质粒在酵母菌中生产所需异源蛋白的方法。当一或多个伴侣蛋白与异源蛋白的基因在相同质粒上被共表达时，外源蛋白的产量大幅增加。

刺激分泌途径的另一种方法是过表达未折叠蛋白反应(UPR)活化转录因子HAC1。转录分析显示，高达330个基因受到HAC1的调控，其中大部分属于分泌或分泌细胞器生物发生的功能组(例如内质网分子伴侣(ER-resident chaperones)、折叠酶、易位因子(Translocon)成分)。

WO 01/72783描述了通过诱导提高未折叠蛋白反应(UPR)从而增加真核细胞分泌外源蛋白的量的方法，其中UPR是通过与选自HAC1、PTC2和IRE1的蛋白共表达而调整的。

虽然这些方法一旦建立起来可以转移到其他菌株，并用于其他蛋白质，但它们受限于对支持其他蛋白分泌的这些蛋白的功能的实际了解。

可以预见的是重组蛋白的高水平分泌，可在多个不同步骤受到限制，如折叠、二硫键形成、糖基化、细胞内的运输或从细胞释放。这些过程中许多还没有被完全理解。根据本领域目前的知识无法预测所述辅助因子功能，即使已经有了宿主生物体的完整基因组DNA序列。