[发明专利]用于生产感兴趣的化合物的经改进的宿主细胞

说明书

发明领域

本发明涉及用于生产感兴趣的化合物的重组宿主细胞。本发明还涉及用于生产此类宿主细胞的方法。本发明还涉及感兴趣的化合物的生产。本发明还涉及经分离的多核苷酸和包含所述多核苷酸的载体和宿主细胞。

发明背景

本发明涉及用于生产感兴趣的化合物的重组宿主细胞。

此类宿主细胞已尤其从WO1998/046774和WO1998/46772中已知，其中宿主细胞在所述宿主细胞染色体的至少两个基本同源的DNA结构域之一中包含感兴趣的多核苷酸，并且其中感兴趣的多核苷酸的拷贝数通过基因转变被提高。

然而，已经证实获得高拷贝基因转变菌株(例如通过根据WO1998/046774和WO1998/46772中的方法获得的菌株)通常被认为是费力的。因此，如果能够改进所述方法，从而使得能够更不费力地构建高拷贝基因转变菌株，则是有利的。

附图说明

图1描绘了置换型载体pGBDEL的物理图谱。相对于amdS标记物标明了用于克隆的侧翼区的多克隆位点。

图2描绘了用于使Aspergillus niger(A.niger)中的hdfA基因失活的置换型载体pDEL-HDFA的物理图谱。置换型载体包含hdfA侧翼区，amdS标记物和E.coli DNA。可以在转化A.niger菌株之前，通过用限制性酶AscI和NotI消化，来去除E.coli DNA。

图3描绘了用于从宿主菌株中确实基因或基因片段的策略。使用的DNA构建体包含amdS选择标记物，所述amdS选择标记物侧翼是要被缺失的基因的同源区(5’和3’)(1)。该构建体通过在相应基因组基因座(2)处双重同源重组(X)而整合，并置换基因组基因拷贝(3)。随后，在同向重复(U)上的重组去除amdS标记物，导致要缺失的基因或基因片段的精确切除(4)。

图4描绘了亲本A.niger菌株CBS 124.903中glaA(葡糖淀粉酶)基因座的物理图谱，和重组菌株GBA 300中三个截短的“X-标记的”ΔglaA基因座(“X”表示BamHI、SalI或BglII限制性位点)。

图5描绘了源自A.niger CBS 124.903的重组菌株GBA 300的glaA DNA扩增子中三个ΔglaA基因座的示意图，每个基因座用不同的限制性位点(BamHI、SalI或BglII)标记。各个glaA基因座长度差异约20到60bp，从而能够通过基于PCR的DNA-标志测试(DNA-flag test)使不同的截短的glaA基因座显影。

图6描绘了用于改造基本同源的DNA结构域的载体pGBGLA-65的物理图谱。基本上，所述载体在两个P_glaA片段之间和3’glaA与3”glaA区之间含有amdS选择标记物。3’glaA与3”glaA区被用于靶向和整合进ΔglaA基因座的相应基因组区中。两个P_glaA片段被用于通过图3中所示的反选择(counterselection)排除amdS选择标记物。一个PglaA片段是截短的P_glaA启动子片段(丢失P_glaA启动子MluI位点3’的最后600bp)，所述片段在amdS反选择后保持存在于基因组中。

图7描绘了具有经改造的BamHI扩增子的菌株中glaA DNA扩增子中的三个ΔglaA基因座。通过在基因组glaA基因座的同源3’glaA和3”glaA基因座之间引入截短的同源葡糖淀粉酶启动子片段，改造BamHI扩增子。

图8描绘了新颖的乙酰胺酶选择标记物和经改造的BamHI扩增子靶向载体pGBAAS-3的物理图谱。glaA启动子发挥靶向区和amdS基因启动子的功能。

图9描绘了新颖的乙酰胺酶选择标记物和经改造的BamHI扩增子靶向载体pGBAAS-4的物理图谱。(截短的)glaA启动子发挥靶向区的作用，gpdA启动子驱动amdS基因的表达。

图10描绘了新颖的表达和经改造的BamHI扩增子靶向载体pGBTOP-11的物理图谱。HinDIII限制性酶可以被用于线性化载体并去除E.coli部分。

图11描绘了新颖的表达和经改造的BamHI扩增子靶向载体pGBTOP-12的物理图谱。NotI限制性酶可以被用于线性化载体并去除E.coli部分。