[发明专利]容易地分离的具有天然免疫球蛋白形式的双特异性抗体

说明书

发明领域

本发明涉及具有重链异源二聚体(即相差至少一个氨基酸的两个免疫球蛋白重链)的抗原结合蛋白或抗体，其允许基于免疫球蛋白重链和经修饰或经突变的免疫球蛋白重链对于亲和试剂的差别亲和力来进行该抗原结合蛋白质的分离。本发明还涉及抗原结合蛋白(包括双特异性抗体)，其具有有着不同的关于A蛋白的亲和力的IgG CH2和CH3区，这允许通过所述IgG区对于A蛋白的差别结合来进行快速分离。

背景

抗体是多功能分子，其携带有独特的对于靶抗原的结合特异性以及通过不依赖于抗原的机制与免疫系统相互作用的能力。许多目前所使用的用于癌症的生物学治疗剂是针对通常在所靶向的癌细胞上过表达的抗原的单克隆抗体。当此类抗体结合肿瘤细胞时，它们可以触发依赖抗体的细胞毒性(ADCC)或依赖补体的细胞毒性(CDC)。不幸地，癌性细胞经常发展出抑制这些正常免疫应答的机制。

近年来，已经进行了努力以开发出具有超过一种抗原结合特异性的抗体样治疗剂，例如双特异性抗体。在癌症疗法的情况下，多特异性形式可以允许这样的可能性，即使用例如，一种特异性来将该分子靶向肿瘤细胞抗原，和另一种特异性来触发通常对于免疫系统不可用的应答。双特异性抗体也可以用作双组分异源二聚受体系统的替代配体，所述双组分异源二聚受体系统通常在当其天然配体与该两个组分结合并将该两个组分带到一起时而被其天然配体激活。

在本领域中已开发了许多形式以处理由具有多种结合特异性的分子所提供的治疗机会。理想地，此类分子应当是表现良好的蛋白质，其易于生产和纯化，并且具有有利的体内特性，例如，适合于所希望的目的的药物动力学，最小的免疫原性，和如果希望，常规抗体的效应子功能。

产生双特异性抗体的最直接的方式(在单个细胞中表达两种不同的抗体)引起多个种类，因为各自的重链形成同源二聚体和异源二聚体，但是只有异源二聚体是所希望的。此外，轻链和重链可能不适当地配对。下面描述了试图以不同的方式解决这些问题的形式的几个实例。

用于双特异性T细胞募召剂(Bispecific T cell Engager，BiTE)分子的一种形式(参见例如，Wolf，E.等人，(2005)Drug DiscoveryToday 10：1237-1244)基于单链可变区片段(scFv)模块。scFv由通过柔性连接体相融合的抗体的轻链和重链可变区构成，这样的轻链和重链可变区通常可以合适地折叠从而这些区域可以结合关联抗原。BiTE将两个具有不同特异性的scFv串联连接在单链上(参见图1A)。这种构造排除了具有两个拷贝的相同重链可变区的分子的产生。此外，设计连接体构造以确保各自轻链和重链的正确配对。

BiTE形式具有几个缺点。首先，scFv分子在其聚集倾向方面是众人皆知的。并且，尽管据说scFv连接体的免疫原性低，但不能排除产生针对BiTE的抗体的可能性。BiTE形式中Fc部分的不存在也使得其血清半寿期非常短，并且这不得不要求频繁的重复施用或通过泵的连续输注这样的复杂化。最后，Fc的不存在也意味着由Fc介导的效应子功能的缺失，所述由Fc介导的效应子功能在某些情况下可能是有益的。

第二种形式(图1B)为小鼠和大鼠单克隆抗体的杂合体，并且依赖于常规的A蛋白亲和层析的改进(参见例如，Lindhofer，H.等人，(1995)J.Immunol.155：219-225)。在该形式中，在同一细胞中(例如，要么作为两个杂交瘤的四源杂交瘤(quadroma)融合物，要么在经改造的CHO细胞中)一起产生小鼠IgG2a和大鼠IgG2b抗体。由于每个抗体的轻链优先地与其关联种类的重链相联合，因此仅可以装配出三种不同的抗体种类：两种亲本抗体，以及通过其Fc部分相联合的各包含一个重链/轻链对的两个抗体的异源二聚体。所希望的异源二聚体可以容易地从该混合物中纯化出来，因为其与A蛋白的结合特性不同于亲本抗体的结合特性：大鼠IgG2b不与A蛋白结合，而小鼠IgG2a结合。因此，该小鼠-大鼠异源二聚体与A蛋白结合，但在比小鼠IgG2a同源二聚体高的pH处洗脱出来，并且这使得可能选择性地纯化该双特异性异源二聚体。与使用BiTE形式一样，这种杂合体形式具有两个单价抗原结合位点。

所述小鼠/大鼠杂合体的缺点在于：由于它是非人的，因而它可能在患者中引起免疫应答，这可能具有有害的副作用(例如，“HAMA”或“HARA”反应)，和/或中和该治疗剂。