[发明专利]核酸扩增方法

说明书

本发明一般性地涉及扩增目的核酸区域的方法，更特别地，本发明涉及通过巢式单管PCR(nested single tube PCR)来扩增目的核酸区域的方法。设计本发明方法以提供下述手段，即选择性失活外引物的功能并在整个反应过程中保持扩增效率。在单管巢式PCR的背景下开发实现用外引物有效扩增而后用内引物有效扩增的手段可用于一些应用，其包括但不限于诊断和/或监测特征为特定基因序列的疾病状况，以及表征或分析特定目的基因区域。本发明方法不仅用于简单的检测，还能进行定量。

发明背景

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聚合酶链式反应(PCR)是用于扩增DNA链的特定区域的技术。DNA链可以是单个基因、基因的仅仅一部分或非编码序列。大部分PCR方法通常扩增多达10k碱基对(kilo base pair，kb)的DNA片段，但一些技术允许扩增大小达40kb的片段(Cheng等，1994，Proc Natl Acad Sci.91：5695-5699)。

目前实施的PCR需要几种基本组分(Sambrook和Russel，2001，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第三版)。这些组分是：

●DNA模板，其包含待扩增DNA片段的区域；

●引物，其与待扩增DNA区域5’和3’端的DNA区域互补；

●DNA聚合酶(例如Taq聚合酶或最适温度在70℃左右的其他热稳定DNA聚合酶)，其用于合成待扩增区域的DNA拷贝；和

●三磷酸脱氧核苷酸(dNTP)，DNA聚合酶利用其构建新DNA。

PCR在包含通常为15-100μl反应体积的小反应管(体积0.2-0.5ml)中进行，所述小反应管被插入热循环仪中。该仪器加热和冷却其中的反应管至反应每个步骤所需的精确温度。大部分热循环仪包含加热盖以防止在反应管帽内部上的冷凝。或者，可在反应混合物上放置一层油以防止蒸发。

因此，PCR是允许较长DNA分子中的DNA序列以指数扩增的方法。该反应包括多个扩增循环，并且在每个循环中每个分子反应的模板是样品中初始DNA链或在先前循环中合成的DNA链。每个PCR循环包括以下步骤

-加热变性以将DNA双链体的两条链分离

-将上游和下游引物与它们的互补序列杂交

-DNA聚合酶将引物延伸以产生模板序列的互补拷贝

通常，选择PCR试剂和条件以使变性、杂交和延伸以接近最大效率进行，从而每个循环中期望序列的量以接近两倍的倍数增加。在PCR结束时产生大量的扩增，例如30个循环的PCR会使初始模板扩增倍数接近2³⁰(1,000,000,000)。这种程度的扩增便于检测和分析扩增产物。

在多个扩增循环后，可以终止PCR并以多种方式分析产物，最常见地是通过凝胶电泳分析。当PCR进行至限定的终点时，扩增产物的量通常不与放入的靶DNA量密切相关，并且这类PCR只是检测特定DNA存在与否的定性工具和/或为了提供进一步分析所用的足量靶DNA。

为了测量信使RNA(mRNA)，该方法首先使用逆转录酶将mRNA转化成互补DNA(cDNA)，然后通过PCR扩增cDNA并用琼脂糖凝胶电泳分析。类似地，逆转录而后进行终点PCR基本上是定性技术。

为了提供定量能力，开发了实时PCR。该方法遵循PCR的一般模式，只是在每个循环中对所扩增的DNA定量。定量的两种常见方法是使用嵌入双链DNA的荧光染料以及使用其荧光在PCR步骤之一中发生变化的经修饰DNA寡核苷酸引物或探针。实时聚合酶链式反应经常与逆转录酶聚合酶链式反应相组合来对低丰度的信使RNA(mRNA)进行定量，使研究者对特定时间或特定细胞或组织类型中的相对基因表达进行定量。

(i)使用结合双链DNA之染料的实时PCR

DNA结合染料(如Sybr Green)在PCR反应中结合所有双链(ds)DNA，导致染料荧光增强。因此PCR中DNA产物的增加导致在每个循环所测量的荧光强度增加，从而允许对DNA浓度进行定量。

(ii)荧光报告序列法