[发明专利]核酸扩增方法

权利要求书

1.一种扩增目的核酸区域的方法，所述方法包括：

(i)将核酸样品与以下项相接触：

(a)针对所述目的区域的第一正向引物和针对所述目的区域的第一反向引物；和

(b)针对所述目的区域的第二正向引物，其中所述第二正向引物针对位于所述第一正向引物所针对序列3’的核酸序列，并且所述第二正向引物的T_m低于所述第一正向引物的T_m；和

针对所述目的区域的第二反向引物，其中所述第二反向引物针对位于所述第一反向引物所针对序列5’的核酸序列，并且所述第二反向引物的T_m低于所述第一反向引物的T_m；和

(c)针对所述第一引物的一种或多种反义寡核苷酸，所述反义寡核苷酸的T_m低于所述第一引物；而且

其中(b)和(c)部分的所述分子可以在所述扩增步骤(ii)之前、期间或之后但在所述扩增步骤(iii)之前加入反应；

(ii)在下述退火温度下扩增步骤(i)的核酸样品，所述退火温度使所述第一引物杂交但不使所述第二引物以及所述反义寡核苷酸杂交；和

(iii)在下述退火温度下扩增步骤(ii)的核酸样品，所述退火温度使所述第二引物以及所述反义寡核苷酸杂交。

2.权利要求1的方法，所述方法包括：

(i)将DNA样品与以下项相接触：

(a)针对所述目的区域的第一正向引物和针对所述目的区域的第一反向引物；和

(b)针对所述目的区域的第二正向引物，其中所述第二引物针对位于所述第一正向引物所针对序列3’的核酸序列，并且所述第二正向引物的T_m低于所述第一正向引物的T_m；和

针对所述目的区域的第二反向引物，其中所述第二反向引物针对位于所述第一反向引物所针对序列5’的核酸序列，并且所述第二反向引物的T_m低于所述第一反向引物的T_m；和

(c)针对所述目的区域的第三正向引物，其中所述第三正向引物针对位于所述第二正向引物所针对序列3’的DNA序列，并且所述第三正向引物的T_m低于所述第二正向引物的T_m；和

针对所述目的区域的第三反向引物，其中所述第三反向引物针对位于所述第二反向引物所针对序列5’的DNA序列，并且所述第三反向引物的T_m值低于所述第二反向引物的T_m值；和

(d)针对所述第一引物的一种或多种反义寡核苷酸，所述反义寡核苷酸的T_m低于所述第一引物；以及针对所述第二引物的一种或多种反义寡核苷酸，每种所述反义寡核苷酸的T_m低于所述第二引物；

其中(b)、(c)和(d)部分的所述分子可以在所述扩增步骤(ii)之前、期间或之后但在所述扩增步骤(iii)之前加入反应；

(ii)在下述退火温度下扩增步骤(i)的DNA样品，所述退火温度使所述第一引物杂交，但不使所述第二引物以及第三引物以及所述反义寡核苷酸杂交；和

(iii)在下述退火温度下扩增步骤(ii)的DNA样品，所述退火温度使所述第二引物以及针对所述第一引物的所述反义寡核苷酸杂交，但不使所述第三引物以及针对所述第二引物的所述反义寡核苷酸杂交；

(iv)在下述退火温度下扩增步骤(iii)的DNA样品，所述退火温度使所述第三引物以及针对所述第二引物的所述反义寡核苷酸杂交。

3.权利要求1或2的方法，其中所述核酸是DNA。

4.权利要求1或2或3的方法，其中所述反义寡核苷酸之一与所述引物的3’端杂交并且包含5’核酸标签序列，所述标签的互补核苷酸序列相对于所述引物杂交位点的5’端相邻的DNA区域之核苷酸序列是错配的。

5.权利要求1或2或3的方法，其中一种或多种所述反义寡核苷酸包含不能进行正常延伸的3’端。