[发明专利]基因矫正的无疾病的诱导的多能干细胞的产生

说明书

相关申请的交叉引用

本申请要求2009年5月27日提交的美国临时申请第61/181,287号的权益，其全部内容在此援引加入，用于所有目的。

发明背景技术

重编程成熟的体细胞产生iPS细胞的可能性^1-5，已经为再生医学展现了前景。iPS细胞的产生在细胞和基因疗法中具有广泛应用，并且可能与遗传性骨髓衰竭(BMF)综合征特别相关，在遗传性骨髓衰竭(BMF)综合征中，造血干细胞数量的逐渐下降限制了外周血细胞的产生。在这些情况下，由其他组织的基因矫正的再编程细胞产生无疾病的造血祖细胞，可以开辟之前未考虑的新的治疗选择。在不同的遗传性BMF综合征中，范科尼贫血(Fanconi Anemia)最常见⁹。FA是罕见的隐性常染色体或X连锁染色体不稳定性病症，其是由目前为止在FA/BRCA通路中所鉴定的13个基因中任意基因中的突变造成的¹⁰。这些患者的细胞表现出典型的染色体不稳定性和对DNA交联剂的高敏感性，这是用于诊断FA的特征¹¹。大多数FA患者发展成BMF，到40多岁时，累积的发生率为90％¹²。另外，FA患者易于发展成恶性肿瘤，主要是急性骨髓性白血病和鳞状细胞癌¹²。目前，FA患者的治疗选择是，移植来自HLA相同同胞的造血移植物，因为来自不相关供体的移植物的输出量很少^13′14。尽管用具有整合载体的自体HSC的基因矫正，可以构成用于FA患者的良好治疗选择，但是所进行的基因疗法试验，目前在临床上并没有取得成功^15′16。FA患者骨髓中造血干细胞的缺乏^16″18不但解释了FA患者会发生BMF，而且还构成限制FA基因疗法功效的主要因子之一^15′16。通过非造血体细胞的再编程，产生基因矫正的FA特异性iPS细胞，会导致可以用于在这些患者中恢复造血功能的大量自体造血干细胞的产生。本文证明，来自范科尼贫血(FA)患者的体细胞，在矫正基因缺陷后，能够被再编程为多能性，从而产生患者特异性iPS细胞。这些细胞系看起来与来自健康个体的人类胚胎干细胞在集落形态、生长特性、多能性相关转录因子和表面标记的表达以及体外和体内分化潜能方面难以区分。最重要的是，已经证明，矫正的FA特异性iPS细胞，能够产生表型正常的即无疾病的骨髓和网织红细胞(erythroid)谱系的造血祖细胞。这些数据提供了概念验证，即iPS细胞技术可以用于产生具有细胞疗法应用潜在价值的疾病矫正的患者特异性细胞。

发明概述

本文特别提供了制备和使用基因矫正的诱导的多能干细胞的高效方法和组合物。基因矫正的诱导的多能干细胞可以通过基因矫正和非多能基因患病细胞的再编程产生。

一方面，提供了制备基因矫正的诱导的多能干细胞的方法。所述方法包括，用编码疾病矫正基因的核酸转染基因患病的非多能细胞，以形成基因矫正的非多能细胞。用编码OCT4蛋白的核酸、编码SOX2蛋白的核酸、编码KLF4蛋白的核酸以及编码cMYC蛋白的核酸转染基因矫正的非多能细胞，以形成基因矫正的转染的非多能细胞。允许基因矫正转染的非多能细胞分裂，由此形成基因矫正的诱导的多能干细胞。

另一方面，提供了制备基因矫正的诱导的多能干细胞的方法。所述方法包括，用编码OCT4蛋白的核酸、编码SOX2蛋白的核酸、编码KLF4蛋白的核酸以及编码cMYC蛋白的核酸转染基因患病的非多能细胞，以形成转染的基因患病的非多能细胞。允许转染的基因患病的非多能细胞分裂，由此形成基因患病的诱导的多能干细胞。并用编码疾病矫正基因的核酸转染基因患病的多能干细胞，以形成基因矫正的诱导的多能干细胞。

另一方面，根据本文所提供的方法，制备基因矫正的诱导的多能干细胞。

另一方面，提供了由基因患病的哺乳动物产生基因矫正的体细胞的方法。所述方法包括，使基因矫正的诱导的多能干细胞与细胞生长因子接触，并允许基因矫正的诱导的多能干细胞分裂，由此形成基因矫正的体细胞。

另一方面，提供了治疗需要组织修复的哺乳动物的方法。所述方法包括，将基因矫正的诱导的多能干细胞给予哺乳动物，并允许基因矫正的诱导的多能干细胞在所述哺乳动物中分裂并分化成体细胞，由此在所述哺乳动物中提供组织修复。