[发明专利]用于微流体装置中车载反应剂的脱水储存的组合物及方法

说明书

相关申请的交叉引用

本申请要求2009年6月12日提交的美国临时专利申请号61/186,442的根据35 U.S.C.§119(e)的权益，该申请以其全文并入本文作为参考。

发明背景

发明领域

本发明一般涉及具有车载(on-board)脱水反应剂的微流体卡盒(microfluidic cartridge)中的分子诊断性测定法领域，其中反应剂通过不经冻干的脱水得以稳定化，本发明还涉及制造具有该车载反应剂的微流体卡盒的方法。

相关技术描述

微流体卡盒由于其方便性、非技术人员可操作性以及方便丢弃而非常适用于诊断性分子生物学。每个卡盒包含用于具体测定法的所有反应剂，这样只有样品需要加入。然后简单地将卡盒插入自动化设备便可实施测定法。然而，自从在20世纪90年代早期首次构想以来，开发这些卡盒的道路已经进行了二十年并通过了各种障碍才有商业化的延续。这些卡盒的保质期是尤其值得关注的问题，因为大多数目标用户无法使用冷冻储存设施。

尽管“冷冻干燥”已经成功应用于潮湿-敏感性反应剂的室温长期储存，然而微流体卡盒的制造不容易将使用冷冻干燥作为此加工过程的部分。在将反应剂置于部分装配好的装置的孔(well)或通道(channel)内后，需要进行另外的装配。粉末或松散的球(sphere)会移动或不能处于正确的位置，并干扰由片(sheet)或卷轴(roll)形成的卡盒进行高速装配。干燥反应剂也会干扰粘合剂的使用。微流体卡盒的最终装配包含脱掩膜(demasking)、层压(lamination)、粘合(gluing)和/或超声焊接的步骤，这些步骤在商业规模上不易与冷冻干燥技术兼容。而且，微流体卡盒装配中遇到的潮湿或热的环境会使冷冻干燥的反应剂甚至在产品完全装配之前就失活。

备选地，已知以玻璃体形式脱水会在冰点(freezing)以上储存过程中保持酶或反应剂的功能，但是此项技术是高度不可预测，并且所述方法和组合物必须针对所研究的每种反应剂而变动——没有具体的成功预期。

装配用于分子生物学测定法的独立(self-contained)微流体卡盒中需要的蛋白质反应剂包括：TAQ聚合酶、DNA聚合酶、RNA聚合酶、逆转录酶、RNA酶H、蛋白酶K、免疫球蛋白、荧光素酶、焦磷酸酶、发色肽酶(chromopeptidase)、溶菌酶等等。其他可能对光、潮湿或热具有敏感性的反应剂包括核苷酸三磷酸、脱氧核苷酸三磷酸、引物和探针。

PCR是分子生物学测定法的庞大家族的基础，并且目前是不可用于微流体卡盒形式的许多分子诊断的金标准。采用PCR用于微流体形式涉及开发用于反应剂的稳定车载储存的方法，所述反应剂包括TAQ聚合酶、逆转录酶、脱氧核苷酸三磷酸、引物和探针。已经证明PCR中所使用的嗜热生物体的DNA聚合酶——由于其首次发现于水生栖热菌(Thermus aquaticus)中而通常称为“TAQ聚合酶”——尤其在室温储存时很难稳定。尽管如此，开发在微流体装置中在室温下具有商业有效保质期的PCR产品依赖于该问题的解决。

TAQ具有5’-3’的聚合酶以及外切核酸酶活性，却没有其他聚合酶的3’-5’的校对(proofreading)能力。然而，该酶结构是与其他DNA聚合酶共有的，并且包含对生拇指内收(opposable thumb-palm)结构域，其被与DNA模板结合相关的深裂口所分开。与TAQ聚合酶的热稳定性相关的特征包括Arg对Lys、Glu对Asp、Ala对Gly、Thr对Ser的比例升高以及不含半胱氨酸。在升高的温度下的折叠通过疏水作用、氢键、静电及范德华相互作用而建立并维持。

酶是复杂折叠的纳米机器，具有与其催化功能及折叠相关的协作运动和灵活性。特定的结构性亚结构域在结构中相对固定，而其他亚结构域更具高流动性和动态性。理想的是，这种天然状态在通过脱水的储存期间得到保持，但是脱水最经常地导致一定水平的折叠去稳定。酶的去折叠会导致变性和活性丧失；脱水(或冷冻)之后产生的结构变化可严重到在再水合之后不会发生重新折叠成为活性“天然状态”形式。